ICS 65.020.20 CCS B 31 DB62 甘肃 省地 方标准 DB62/T4903—2024 樱桃无病毒苗木繁育技术规程 Technical specification for virus-free seedling breeding of cherry 2024-04-24发布 2024-07-24实施 甘肃省市场监督管理局 发布 DB62/T4903—2024 前言 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由甘肃省农业农村厅提出并监督实施。 本文件由甘肃省果树果品标准化技术委员会归口。 本文件起草单位：甘肃农业大学、兰州市副食品基地建设中心、宁县果业发展中心、天水师范学院、 天水市麦积区果业发展中心、礼县苹果研究所、静宁县李店镇农业农村综合服务中心、临夏州农业技术 推广服务中心。 本文件主要起草人：马宗桓、梁国平、刘军德、陈佰鸿、毛娟、杨少华、王雄伟、郭志刚、高永新 李玉涛。 本文件由甘肃农业大学负责解释。 1 DB62/T4903—2024 樱桃无病毒苗木繁育技术规程 1范围 本文件规定了樱桃无病毒苗木繁育技术中的术语和定义、脱毒苗获得、无病毒苗木采穗圃、无病毒 无性系砧木圃、无病毒苗木繁育、出圃苗木的规格要求、苗木出圃及档案记录。 本文件适用于樱桃品种红灯、‘胜利和砧木大青叶'等的无病毒苗木繁育。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 文件。 GB9847苹果苗木 NY/T393绿色食品农药使用准则 NY/T 1085 5苹果苗木繁育技术规程 NY/T22813 苹果病毒检测技术规范 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3. 1 樱桃无病毒苗 不携带李矮缩病莓（prunedwarfvirus,PDV）、李属坏死环斑病毒（Prunusnecroticringspotvirus, PNRSV）、樱桃小果病毒（Littlecherryvirus,LChV）、樱桃绿环斑驳病毒（Cherrygreenringmottlevirus, CGRIMV）、樱桃病毒A（CherryvirusA，CVA）、樱桃坏死锈斑病毒（Cherrynecroticrustymottlevirus， CNRMV）、苹果褪绿叶斑病毒（Applechloroticleafspotvirus，ACLSV）的樱桃苗木。 3.2 樱桃无病毒母本圃 用于提供樱桃品种及砧木无病毒枝条的圃地。 4脱毒苗获得 4.1脱毒材料 选择红灯'和胜利等樱桃品种，砧木选择大青叶’，采取经过3a以上观察，品种纯正、生长健壮、 外观无异常的母本树枝条作待脱毒材料。 4.2脱毒处理 4.2.1热处理脱毒 4.2.1.1无菌外植体获得 1 DB62/T4903—2024 从待脱毒品种植株剪取枝条，采用切接法嫁接于盆栽实生砧苗。每品种15盆。嫁接成活后，按常规 苗在室外进行管理。 4.2.1.2热处理 翌年2月上中旬，将待脱毒盆栽苗移入温室，将1a生接穗枝条剪截留3个～5个饱满芽，待萌动、长 出幼叶后，移于恒温热处理箱，温度控制至28℃～30℃。5d～7d盆栽苗长至3片～5片新叶时，将温度调 至38℃C1°℃C，进行热处理并计时。 4.2.1.3嫁接 热处理28d后，从抽发新梢顶端，切取1.0cm～1.5cm嫩梢，采用劈接或皮下嫁接法嫁接于盆裁脱毒 实生砧木，用塑料薄膜包扎，套白色透明塑料袋保湿，置于阴凉处，12d～16d除塑料袋，8d～12d移入 温室内阳光处，待长出3片～5片新叶，移至室外炼苗10d～15d，再移入苗圃，按正常苗进行管理。 4.2.2茎尖培养脱毒法 4.2.2.1不定芽的诱导 选取生长健壮、无病虫害的幼嫩新梢，去掉叶片，保留新梢顶尖。用流水冲洗1h3h，在无菌条件 在解剖镜下剥离幼叶和叶原基，切取0.2mm～0.4mm茎尖，将其接种于分化培养基，培养基类型为MS， 件为光照强度1500Lx～2000Lx，14h～18h/光照，6h～10h/黑暗，空气相对湿度65%～75%，培养温度25C±2C。 30d～35d换1次培养基直至分化出新芽。 4.2.2.2增殖培养 将诱导获得不定芽接种于增殖培养基诱导增殖，培养基类型为MS，包含固体MS培养基4.43g/L、蔗 25d～30d转接1次。 4.2.2.3诱导生根 将高1.5cm以上健壮嫩苗转于生根培养基诱导生根，培养基类型为MS，包含固体MS培养基2.21g/L、 蔗糖25g/L、琼脂6.5g/L、IAA0.3mg/L、NAA0.3mg/L，20d～30d生新根。 4.2.2.4炼苗移栽 行透气锻炼。喷清水2次/d～3次/d，48h～72h从瓶中取出幼苗，于清水中洗净附着根系残留的培养基， 移栽至营养钵，并置于配有遮阳网的小拱棚，浇足水分和覆盖薄膜进行保湿。每隔6d8d追施1次1/8MS 营养液，逐渐增加光照，待营养钵苗有4片～5片新叶，株高≥5cm进行移栽。 4.2.2.5移入苗圃 经过4.2.2.4处理组培苗移至室外炼苗7d～14d。圃地消毒后开沟起垄，株施生物有机肥1kg～2kg 15:15:15氮磷钾三元复合肥0.25kg~0.5kg，将苗带土移栽，灌足水。 4.2.3热处理结合茎尖培养脱毒法 2 DB62/T4903—2024 4.2.3.1不定芽的诱导 同4.2.2.1。 4.2.3.2增殖培养 同4.2.2.2。 4.2.3.3热处理 将4.2.3.2获得试管苗在38℃士1℃C光照培养箱中培养4周~6周，切取2mm～4mm茎尖进行培养，不定 芽诱导培养基配方及培养条件同4.2.3.1，增殖培养培养基配方及培养条件同4.2.3.2。 4.2.3.4诱导生根 同4.2.2.3。 4.2.3.5炼苗移栽 同4.2.2.4。 4.2.3.6移入苗圖 同4.2.2.5。 4.2.4病毒检测 4.2.4.1木本指示植物法 具体操作步骤见NY/T2281。 4.2.4.2酶联免疫吸附法（ELISA） 方法见NY/T2281。表现显阳性反应则被淘汰；表现显阴性反应，则采用木本指示植物法进行检测。 4.2.4.3反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）法 采集0.2g植物样本，使用RNA提取试剂盒，反转录试剂盒将提取的RNA反转录成cDNA，通过RT-PCR 进一步检测，具体方法见NY/T2281中。 4.3无病毒原种保存 4.3.1田间保存 无病毒原种树栽植在土壤经过消毒、不重茬的园地，与其他果园或苗圃相距200m以上，须搭建人 工网室进行隔离。每个品种保存10株以上。每2a进行1次病毒检测，发现问题随即淘汰。 4.3.2组培保存 组织培养获得无病毒原种保留在瓶内继代培养。每2a进行病毒检测1次，发现问题株随即淘汰。 5无病毒苗木采穗圃 5.1母本来源及要求