ICS65.020.20 CCSB16 3707 潍坊市地方标准 DB3707/T133—2024 西瓜枯萎病菌鉴定技术规程 Technicalcodeofpracticeforidentificationofwatermelonfusariumwilt pathogen 2024-12-19发布 2025-01-20实施 潍坊市市场监督管理局  发布 DB3707 Ϋ·»Êеط½±ê׼ȫÎĹ«¿ªDB3707 Ϋ·»Êеط½±ê׼ȫÎĹ«¿ªDB3707/T133—2024 I目次 前言..................................................................................II 1范围.................................................................................1 2规范性引用文件.......................................................................1 3术语和定义...........................................................................1 4鉴定程序.............................................................................1 5田间取样.............................................................................2 6症状检查.............................................................................2 7病原菌的鉴定.........................................................................3 8过程记录及档案保存...................................................................4 附录A（资料性）西瓜枯萎病危害症状.....................................................5 附录B（资料性）马铃薯蔗糖琼脂培养基（PSA）配制方法....................................6 附录C（规范性）西瓜枯萎病菌致病性测定.................................................7 附录D（资料性）西瓜枯萎病菌菌落形态及分生孢子形态特征.................................8 附录E（资料性）西瓜枯萎病菌DNA的提取.................................................9 附录F（资料性）西瓜枯萎病菌PCR检测..................................................10 参考文献..............................................................................11 DB3707 Ϋ·»Êеط½±ê׼ȫÎĹ«¿ªDB3707/T133—2024 II前言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由潍坊市农业农村局提出、归口并组织实施。 本文件起草单位：优奈尔生物科技有限公司、潍坊郭牌农业科技有限公司、潍坊市农业科学院。 本文件主要起草人：由守昌、杨猛、金炳奎、王昌盛、徐立功、孙继峰、刘金宝、王海艳、王逍逍、 杨珊、辛国凤、杨琪、邢石磊。 DB3707 Ϋ·»Êеط½±ê׼ȫÎĹ«¿ªDB3707/T133—2024 1西瓜枯萎病菌鉴定技术规程 1范围 本文件确立了西瓜枯萎病菌鉴定技术程序，规定了田间取样、症状检查、病原菌的鉴定、过程记录 及档案保存的指示，以及上述阶段之间的转换条件，描述了过程记录、建立档案等追溯方法。 本文件适用于西瓜枯萎病菌的检测和鉴定。 2规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 3术语和定义 SN/T2589-2010界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 症状symptom 植物受病原物或不良环境因素的侵扰后，内部的生理活动、外观或生长发育所显示的某种异常状态。 [来源：SN/T2589—2010，定义3.2] 4鉴定程序 西瓜枯萎病菌鉴定技术规程包括田间取样、症状检查、病原菌的鉴定、过程记录及档案保存4个阶 段。程序流程如图1所示。 DB3707 Ϋ·»Êеط½±ê׼ȫÎĹ«¿ªDB3707/T133—2024 2 图1西瓜枯萎病菌鉴定流程图 5田间取样 宜选择在西瓜枯萎病发病初期至病情发展到一定程度（但尚未完全枯死）的植株。取样时，应戴好 一次性手套，小心地将根部从土壤中取出，随后迅速将样本植株放入密封的塑料袋或适宜容器中。在低 温条件下运输至实验室，如将样品放置在放有冰袋的泡沫盒中或4℃～8℃冷藏小冰箱内。运输过程中 应严格避免样本受到挤压、碰撞和震动，可在容器内放置缓冲材料，如柔软的泡沫或海绵等。 6症状检查 6.1症状检查操作如下: a)观察病株叶部有无西瓜枯萎病的可疑症状（见附录A），如出现叶片萎蔫、发黄、干枯等。 DB3707 Ϋ·»Êеط½±ê׼ȫÎĹ«¿ªDB3707/T133—2024 3b)用小刀进行纵切和横切病株根部病健交界处，观察有无西瓜枯萎病的可见症状（见附录A）， 如基部有褐色条斑或发生表皮纵裂、维管束变褐等。 6.2样本在经详细登记（包括样本来源、取样时间、取样地点等信息）和经手人签字后，应存放在4℃ 冰箱中冷藏，以备复核。当保存期满后，应采用高压灭菌处理后再行处置。应建立样本保存数据库，记 录每个样本的保存位置、保存时长等信息。 7病原菌的鉴定 7.1实验用仪器设备和主要试剂的准备 7.1.1实验仪器 实验仪器包括生物显微镜、超净工作台、高压灭菌锅、高速冷冻离心机、PCR仪、凝胶成像仪、电 泳仪、恒温培养箱、-80℃超低温冰箱、4℃冰箱、-20℃冰箱、组织破碎仪、微量移液器（0.1μL～ 2.5μL、1μL～10μL、10μL～100μL、20μL～200μL、100μL～1000μL）等。 7.1.2主要试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。 ——1%NaClO、75%酒精、30%灭菌甘油、灭菌石蜡油、琼脂、DNA提取相关试剂、PCR相关试剂、电 泳相关试剂等。 ——试验中除PCR试验所用的试剂配制为三级水外，其他用水均为一级水。 ——马铃薯蔗糖琼脂培养基（PSA）（配制方法见附录B）。 7.2病原菌的培养 7.2.1直接培养 将样本根部用75%酒精进行消毒处理30s后，用无菌水冲洗3遍，用1%琼脂进行保湿，置于28℃条 件下培养2d～4d。 7.2.2分离培养 将病株根部或茎部病健交界处切成5mm左右的小块，在1%NaClO溶液中浸泡2min，用75%酒精浸泡 15s，无菌水冲洗3次，灭菌滤纸片吸干水分后放置在PSA培养基上，用parafilm膜封口，置于28℃恒 温培养箱中倒置培养1d～3d。用挑针挑取单根菌丝接种到新鲜PSA培养基上纯化培养5d。按照附录C 的规定将病原菌接种到健康植株上进行致病性测定，并密切观察植株在接种后的发病情况，如发病时间、 症状表现等。 7.3形态学鉴定 用灭菌牙签挑取按照7.2条培养获得的菌丝及分生孢子，制成临时玻片，在生物显微镜下观察分生 孢子形态特征（见附录D）。 病菌在PSA培养基平板上菌落突起，白色致密呈絮状，菌丝体为有隔菌丝、无色，在培养基上培养4 d～5d后出现粉红色，小型分生孢子无色、长椭圆形、单胞或偶有一个分隔。大型分生孢子镰刀形、无 色、有1个～5个隔膜、多数为3个隔膜。 7.4分子生物学鉴定 DB3707 Ϋ·»Êеط½±ê׼ȫÎĹ«¿ªDB3707/T133—2024 4将分离出的可疑菌落，接种到PSA培养基上，28℃培养5d，用无菌手术刀刮取菌丝，用CTAB法（见 附录E）提取可疑分离物DNA。将提取得到的DNA用ITS1/ITS4、EF1-728F/EF1-986R、CYLH3F/CYLH3R、 ACT-512F/ACT-783R作为引物分别扩增病原菌菌株的核糖体内部转录间隔区（thenuclearribosomal internaltranscribedspacerregion，ITS）、翻译延伸因子（translationelongationfactor1-a， TEF-1）、组蛋白（histoneH3，HIS）、肌动蛋白基因（actingenes，ACT）。将所获得的片段提交测 序，并根据参考序列信息构建系统发育树（见附录F），从而确定可疑分离物的种类。 7.5结果判定 应采用形态学检测和分子生物学鉴定相结合的方法，进行结果判定。 a)分离菌株的培养性状和形态特征符合7.3条描述，且根据ITS、TEF-1、HIS