ICS65. 020. 20 CCS B 61 DB3706 烟銀台銀市銀地 愛方 标准 DB 3706/T 100—2024 苹果砧木和品种双脱毒苗木组培繁育技术 规范 Technical specifications for tissue culture and breeding of apple rootstocks and Varieties with double virus-free seedlings 2024-07-30 发布 2024-08-30实施 烟台市市场监督管理局 发布 DB 3706/T 100—2024 目 次 前言 1范围 2 规范性引用文件 3 术语和定义. 4 外植体类型及取材 5无菌体系建立 5.1接种工具灭菌. 5.2外植体消毒. 5.3转接外植体培养基配方 5.4转接外植体培养基配制 5.5外植体转接. 6初代培养 6. 1 初代培养基配方. 6. 2 初代培养基配制. 6.3初代培养环境控制 ７ 脱毒处理 7. 1 热处理 7. 2 茎尖剥离. 7. 3 茎尖培养. 7.4 病毒检测 8脱毒苗继代培养 8. 1 继代培养基配方 8.2继代培养条件. 8.3继代培养污染控制， ９生根培养 9. 1 生根培养基配方. 9.2生根培养环境控制 9.3生根转接方式及材料要求 10脱毒种苗温室化 10.1驯化时期， 10.2瓶苗分级 10.3驯化流程， 11移栽管理， 1 DB 3706/T 100—2024 前言 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由烟台市农业农村局提出、归口并组织实施。 II DB 3706/T 100—2024 苹果砧木和品种双脱毒苗木组培繁育技术规范 1范围 本文件规定了苹果砧木和品种双脱毒苗木繁育的外植体类型及取材、无菌体系建立、初代培养、脱 毒处理、脱毒苗继代培养、生根培养、脱毒种苗温室别化和移栽管理。 本文件适用于烟台地区苹果砧木和品种双脱毒种苗繁育工厂化作业 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 3术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4外植体类型及取材 选取当年生枝条的茎尖或茎段。4月～6月，选取大小1.5cm～2.5cm的茎尖；11月～次年2月，选 取3cm左右、包含2个腋芽的茎段。 无菌体系建立 5.1接种工具灭菌 将手术刀、镊子和接种盘等接种工具放置高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌15 min。 5.2外植体消毒 5.2.14月～6 月在大田选取的外植体消毒流程包括：流水冲洗（2 h）→75%的酒精浸泡（20 s）→ 0.1 %氯化汞溶液浸泡（5 min～7 min）→抗坏血酸无菌液（50 mg/L）冲洗5遍。 5.2.211月～2月选取的外植体需先在光照培养箱中预培养出新芽，再对新芽进行消毒，其流程包括： 0.1 %氯化汞溶液浸泡（5 min～7min）→抗坏血酸无菌液（50 mg/L）冲洗 5遍。 5.3转接外植体培养基配方 改良木本植物用培养基(WPM)+300 mg/L维生素C+0.5%活性炭十6%琼脂粉十20 g/L蔗糖。 5.4转接外植体培养基配制 按照配方煮制培养基。 5.5外植体转接 DB 3706/T 100—2024 消毒好的的外植体用镊子置于接种盘内，用手术刀将每端切割2mm（有叶片的顶芽只保留最上端2 片叶），随后接到培养基上。 6初代培养 6.1初代培养基配方 改良WPM十0.5 mg/L 6-BA＋6 %琼脂粉十20 g/L蔗糖。 6.2初代培养基配制 按照配方煮制培养基。 6.3初代培养环境控制 在光照强度1800Lux～2400 Lux，温度21℃～23℃的无菌培养室内进行光照培养，光照时间12 h/d～14 h/d. 7 脱毒处理 7.1热处理 将初代培养好的组培瓶苗放到温度25℃递增到38℃的光照培养箱内，保持38℃恒温、24h光照 处理32 d～38 d。 7.2 茎尖剥离 经过热处理后存活的瓶苗，高倍解剖镜下剥离0.2 mm～0.5 mm的植株生长点。 7.3茎尖培养 将经过热处理及尖剥离后的生长点定植于温度20℃～23℃、光照强度1800 Lux～2200Lux的培 养基中，直到茎尖长到约3cm左右的完整植株。 7.4 病毒检测 经过脱毒处理的茎尖繁殖出20株左右瓶苗时，随机抽取10株到第三方机构（拥有病毒检测资格）进 行病毒检测，确定是否含有苹果锈果类病毒（Apple scar skin viroid，ASSVD）、苹果花叶病毒（Apple mosaic virus，ApMV）、苹果褪绿叶斑病毒（Apple chlorotic leaf spot virus，ACLSV）、苹果茎沟 病毒（Apple stem grooving virus，ASGV）和苹果茎痘病毒（Apple stem pitting virus，ASPV）， 经病毒检测，脱除上述病毒苗可进行继代培养。 8 脱毒苗继代培养 8.1继代培养基配方 WPM十0.3 mg/L 6-BA十6 %琼脂粉十20 g/L蔗糖，pH值为5.6，扩繁周期为32d～38 d。 2 DB 3706/T 100—2024 8.2 继代培养条件 光照时数12 h/d～14 h/d，光照强度2400 Lux～3200 Lux。 8.3继代培养污染控制 每天对地面进行次氯酸消毒，每三天对空间莫氧消毒一次，全年污架率控制在3%以下。 ９生根培养 9.1生根培养基配方 1/2 WPM十IBA十蔗糖3%十琼脂粉0.5 %，pH值为5.6。 9.2生根培养环境控制 转接后前3d黑暗处理，温度25℃左右；3d后开始光照，每天光照时数12h～14h，光照强度2800 Lux～3500 Lux，培养温度25℃～28℃。 9.3生根转接方式及材料要求 生根苗转接要求粗度直径1mm以上，高度1.5cm～2.5cm，叶片保留3个～5个，下部切口应在腋芽 上部；根据培养瓶大小定植不同的株数。 10脱毒种苗温室驯化 10.1驯化时期 4月～11月上旬。 10.2瓶苗分级 一 级苗为高度3 cm，具有3条以上3cm根系；二级苗为高度1.5 cm～3cm，具有2条以上3 cm根系。 10.3 驯化流程 炼苗（20d）→开盖（移栽前一天下午）→出瓶（瓶苗大小分级）→培养基的清理（清水清洗3遍) →消毒（500倍的50%多菌灵浸泡2 min～4 min）→移栽（提前准备好苗床）→后期管理。 11移栽管理 移栽后的前3d应注意防风通气、保温保湿，分别应在第1d、第6d喷施800倍3%并冈·嘧首素，第 12d左右喷施叶面肥配合70%乙铝·锰锌800倍液，16d以后每7d～10d喷施一次叶面肥，每10d～15 d喷施一次杀菌剂，至少3种杀菌剂交替使用（以生物制剂为主，例如并岗嘧首素、多抗霉素、春雷霉素 等）。穴盘苗长至15cm～20 cm时进行放风锻炼。 3