ICS 11.220 CCS B 41 37 山东省 地方标准 DB37/T 4754.3—2024 动物疫病鉴别检测技术 第3部分： 禽腺病 毒Ⅰ群与禽腺病毒 Ⅲ群 Animal disease identification and detection technology —Part 3: Group I Avian adenoviruses and Group III Avian adenoviruses 2024 - 12 - 30发布 2025 - 01 - 30实施 山东省市场监督管理局 发布 DB37/T 4754.3 —2024 I 前言 本文件按照GB/T 1.1—2020 《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件是DB37/T 4754《动物疫病鉴别检测技术》的第 3部分。DB37/T 4754 已经发布了以下 部分： —— 第1部分：猪瘟强毒与猪瘟疫苗弱毒； —— 第2部分：兔出血症病毒经典型与兔出血症病毒 2型； —— 第3部分：禽腺病毒Ⅰ群与禽腺病毒Ⅲ群。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。 本文件由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 DB37/T 4754.3 —2024 II 引言 动物疫病是影响山东省畜牧业健康发展的重要因素之一。不同病原或者相同病原的不同血清型/ 基 因型引起疫病的临床病症具有一定程度的相似性，同时，有些疫病弱毒疫苗的使用干扰了病原的检测。 动物疫病鉴别检测技术标准的建立，规定了对不同病原、相同病原的不同血清型/基因型以及弱毒疫苗 株的鉴别检测，为山东省动物疫病精准防控提供了技术支持，对于促进畜牧业健康发展具有重要意义。 禽腺病毒（ Avian adenovirus ）分为3个属：禽腺病毒属（ Aviadenovirus ）、唾液腺病毒属 （Siadenovirus ） 和腺胸腺病毒属 （Atadenovirus ） 。 禽腺病毒Ⅰ群包括 A～E 5个种12个血清型 （ FAdV-1～ 8a、8b～11）为禽腺病毒属成员，感染鸡、火鸡、鸭、鹅、鸽子以及珍珠鸡、雉鸡、鹦鹉、鸵鸟等野生 禽类并引起心包积水综合征、 包涵体肝炎、 坏死性胰腺炎和肌胃糜烂症以及呼吸道疾病等典型临床病症； 禽腺病毒Ⅱ群为唾液腺病毒属，成员包括火鸡出血性肠炎病毒、雉鸡大理石脾病毒、鸡脾肿大病毒等， 其中火鸡出血性肠炎病毒主要危害火鸡养殖；禽腺病毒Ⅲ群唯一成员减蛋综合征病毒（Egg drop syndrome virus ，EDSV），又称为鸭腺病毒 A种，为腺胸腺病毒属，该病毒来源于鸭，易感宿主包括 鸡、 鸭、鹅等禽类，导致产蛋下降及产色浅、壳薄和无壳蛋，也可引起雏鹅呼吸道病征。我国养禽业主要包 括鸡、鸭、鹅、鸽子等，禽腺病毒Ⅰ群和Ⅲ群易感宿主均包括鸡、鸭、鹅等，是影响我国养禽业健康发 展的重要病原，且二者具有部分相同群抗原，因此，有必要针对禽腺病毒Ⅰ群与Ⅲ群开展鉴别检测，对 于精准防控禽腺病毒感染具有重要意义。《动物疫病鉴别检测技术》拟由三个部分构成： —— 第1部分：猪瘟强毒与猪瘟疫苗弱毒。目的在于规范猪瘟强毒与猪瘟疫苗弱毒 SYBR Green Ⅰ 荧光RT-PCR鉴别检测技术的操作， 便于检测技术在猪瘟临床诊断、 流 行病学调查、 检验检疫、 猪瘟疫苗质量控制等方面的稳定应用。 —— 第2部分：兔出血症病毒经典型与兔出血症病毒 2型。目的在于规范兔出血症病毒经典型与 兔出血症病毒 2型实时荧光 RT-PCR鉴别检测技术的操作， 便于检测技术在兔出血症临床诊断、 流行病学调查、检验检疫等方面的稳定应用。 —— 第3部分：禽腺病毒Ⅰ群与禽腺病毒Ⅲ群。目的在于规范禽腺病毒 Ⅰ群与Ⅲ群 PCR鉴别检测 技术的操作，便于检测技术在禽腺病毒病临床诊断、流行病学调查、检验检疫等方面的稳定 应用。 DB37/T 4754.3 —2024 1 动物疫病鉴别检测技术 第3部分：禽腺病毒Ⅰ 群与禽腺病毒Ⅲ 群 1 范围 本文件描述了禽腺病毒Ⅰ群与Ⅲ群聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR ）的鉴别检 测方法。 本文件适用于含有禽腺病毒Ⅰ群与Ⅲ群的鉴别检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 试验原理 PCR技术是在 Taq DNA聚合酶作用下，以靶DNA 为模板、靶 DNA序列5'端与3'端互补的且长度一般为 18 bp～27 bp的特异性寡核苷酸为引物、 dNTP为反应原料，按照碱基配对及半保留复制原理，经变性、 退火、延伸循环多次，DNA扩增产物呈指数型上升，并通过琼脂凝胶电泳获知扩增产物的分子量从而判 定结果。本文件对禽腺病毒Ⅰ群与Ⅲ群靶基因进行 PCR扩增，并通过特异性扩增产物分子量差异，用于 禽腺病毒Ⅰ群与Ⅲ群的鉴别检测。 5 试剂或材料 除非另有说明，所用试剂均为分析纯。 水：GB/T 6682 ，一级。 10 000×核酸荧光染料（ GelRed/GelGreen ）。 DL 2 000 DNA 分子标准：包括 100 bp、250 bp、500 bp、750 bp、1 000 bp、2 000 bp分子量标准。 PCR反应试剂：10× Taq DNA聚合酶缓冲液、 Taq DNA聚合酶（5 U/µL）、dNTP（2.5 mmol/L）； 2 ×PCR反应预混液（ 2×Taq PCR Mix ）。 磷酸盐缓冲液（ PBS）：0.01 mol/L、pH7.4。 称取氯化钠（NaCl） 8.0 g、氯化钾（ KCl）0.2 g、磷酸二氢钾（KH 2PO4）0.2 g、磷酸氢二钠（Na 2HPO4 ･12H 2O）2.9 g，依次溶于 800 mL水中，用盐酸调 pH值至7.4，于高压灭菌锅121 ℃灭菌20 min，4 ℃保存。 0.5 mol/L EDTA 溶液：pH8.0。 DB37/T 4754.3 —2024 2 称取EDTA 18.61 g，加灭菌水至 80 mL，用氢氧化钠调 pH至8.0，充分溶解，定容至100 mL，室温保 存。 1×TAE缓冲液。 取20 mL 50 ×TAE电泳缓冲液，加灭菌水至1 000 mL，室温保存。 1.5%琼脂糖凝胶。 称取琼脂糖 1.5 g，放 入100 mL 1×TAE电泳缓冲液中， 加热融化， 温度降至50 ℃～60 ℃时， 加入10 μL 10 000×核酸荧光染料（ GelRed/GelGreen ），均匀铺板，厚度为3 mm～5 mm。 6×核酸电泳加样缓冲液。 称取EDTA 4.4 g、溴酚蓝 0.25 g、二甲苯腈蓝FF 0.25 g ，依次溶于 200 mL灭菌水中，加入180 mL 甘 油，调pH值至7.0，定容至500 mL ，分装室温保存。 病毒DNA提取试剂盒。 无核酸酶离心管（ 1.5 mL）。 PCR检测反应管（ 0.2 mL）。 禽腺病毒Ⅰ群 4型、禽腺病毒Ⅲ群 EDSV阳性对照样品和阴性对照样品，均 -20 ℃保存。阳性对 照：禽腺病毒Ⅰ群 4型、禽腺病毒Ⅲ群 EDSV基因组DNA；阴性对照： SPF鸡肝脏组织。 引物：引物名称和序列按照附录 A执行。 6 仪器设备 A型Ⅱ级生物安全柜。 电子天平：精度 0.01 g。 高速冷冻离心机：转速≥ 12 000 r/min 。 微型低速离心机：转速≤ 6 000 r/min 。 冰箱：-20 ℃。 PCR检测仪。 凝胶成像仪。 电泳仪、电泳槽。 高压灭菌锅。 7 样品 样品采集、保存和运输按照NY/T 541 执行。 8 试验步骤 样品处理 8.1.1 肝脏组织样品 在A型Ⅱ级生物安全柜中处理。使用电子天平称取1.00 g±0.05 g 样品，剪碎后与 PBS按1:5（W/V） 比例混合，研磨成组织匀浆，装入1.5 mL无核酸酶离心管，置于高速冷冻离心机，4 ℃、12 000 r/min 离心5 min，取上清液提取核酸。 8.1.2 拭子样品 DB37/T 4754.3 —2024 3 置于500 μL的PBS中充分震荡浸润，反复挤压拭子 3次，4 ℃、5 000 r/min离心 5 min，取上清液提取 核酸。 8.1.3 病毒培养物样品 收获的病毒细胞培养液、禽胚尿囊液或卵黄液，直接提取核酸。 8.1.4 阴性对照样品 处理同8.1.1。 8.1.5 检毕样品 按照NY/T 541处理。 核酸提取 按照病毒DNA 提取试剂盒说明书， 提取待检样品、 阴性对照样品的DNA 。提 取 的DNA样品应立即检测， 否则应-20 ℃冰箱保存 30 d。 PCR检测 8.3.1 反应体系配置 PCR检测反应体系见表 1。也可使用等效的商品化 2×PCR反应预混