ICS 11.220 CCS B 41 37 山东省 地方标准 DB37/T 4754.2—2024 动物疫病鉴别检测技术 第2部分：兔出 血症病毒经典型与兔出血症病毒 2型 Animal disease identification and detection technology —Part 2: RHDV and RHDV2 2024 -12 - 30发布 2025 - 01 - 30实施 山东省市场监督管理局 发布 DB37/T 4754.2 —2024 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件是DB37/T 4754《动物疫病鉴别检测技术》的第 2部分。DB37/T 4754已经发布了以下部分： ——第1部分：猪瘟强毒与猪瘟疫苗弱毒； ——第2部分：兔出血症病毒经典型与兔出血症病毒2 型； ——第3部分：禽腺病毒Ⅰ群与禽腺病毒Ⅲ群。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。 本文件由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 DB37/T 4754.2 —2024 II 引言 动物疫病是影响山东省畜牧业健康发展的重要因素之一。不同病原或者相同病原的不同血清型/ 基 因型引起疫病的临床病症具有一定程度的相似性，同时，有些疫 病弱毒疫苗的使用干扰了病原的检测。 动物疫病鉴别检测技术标准的建立，规定了对不同病原、相同病原的不同血清型/基因型以及弱毒疫苗 株的鉴别检测，为山东省动物疫病精准防控提供了技术支持，对于促进畜牧业健康发展具有重要意义。 兔出血症（Rabbit haemorrhagic disease ，RHD）是由杯状病毒科（ Caliciviridae ）兔病毒属 （Lagovirus ）成员兔出血症病毒（Rabbit haemorrhagic disease virus ，RHDV）引起的一种急性、强 传染性、 病死率高达40% ～90%的传染病， 其典型病变包括呼吸系统出血， 实质器官淤血、 肿大、 出血等， 我国将其列为二类动物疫病（中华人民共和国农业农村部公告 第573号），严重威胁着我国养兔业的健 康发展。1984年，由 RHDV经典型引起的 RHD首先在我国暴发，继而在各大洲广泛流行，并不断发生遗传 演变，但抗原性保持相对稳定。2010 年，由RHDV2型引发的兔出血症首先在法国暴发，不仅导致育肥兔 大量死亡，以RHDV 经典型株制备的灭活疫苗无法提供完全免疫保护，可见其抗原性发生较大变异，之后 RHDV2型在欧洲、非洲、大洋洲部分国家开始流行，在瑞典、葡萄牙、澳大利亚等国， RHDV2型已经取代 RHDV经典型成为主要流行毒株。我国于2020年 5月在四川省确诊了由RHDV2型 引发的疫病，作为世界第一 养兔大国，若该变异毒株发生大规模流行，势必加大防控难度。因此，建立一种可鉴别RHDV 经典型与 RHDV2型的检测技术对于该病的防控具有重要意义。《动物疫病鉴别检测技术》拟由三个部分构成： —— 第1部分：猪瘟强毒与猪瘟疫苗弱毒。目的在于规范猪瘟强毒与猪瘟疫苗弱毒 SYBR Green Ⅰ荧光RT-PCR鉴别检测技术的操作，便于检 测技术在猪瘟临床诊断、流行病学调查、检验 检疫、猪瘟疫苗质量控制等方面的稳定应用。 —— 第2部分：兔出血症病毒经典型与兔出血症病毒 2型。目的在于规范兔出血症病毒经典型与 兔出血症病毒 2型实时荧光 RT-PCR鉴别检测技术的操作，便于检测技术在兔出血症临床诊 断、流行病学调查、检验检疫等方面的稳定应用。 —— 第3部分：禽腺病毒Ⅰ群与禽腺病毒Ⅲ群。目的在于规范禽腺病毒Ⅰ群与Ⅲ群 PCR鉴别检测 技术的操作，便于检测技术在禽腺病毒病临床诊断、流行病学调查、检验检疫等方面的稳定 应用。 DB37/T 4754.2 —2024 1 动物疫病鉴别检测技术 第2部分：兔出血症病毒经典型与兔出血 症病毒2型 1 范围 本文件描述了兔出血症病毒（Rabbit haemorrhagic disease virus,RHDV）经典型与兔出血症病毒 2型（Rabbit haemorrhagic disease virus 2,RHDV2 ）实时荧光反转录聚合酶链反应（Real-time RT - PCR）鉴别检测方法。 本文件适用于兔及其产品中RHDV 经典型与 RHDV2型的鉴别检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 试验原理 在游离状态下， SYBR Green Ⅰ染料只发出微弱的荧光，与双链 DNA结合后荧光信号大幅度增强。在 PCR反应过程中， SYBR Green I染料与扩增的双链 DNA产物结合后发出荧光，且伴随扩增产物的指数型上 升， 荧光强度也随之上升并被荧光 PCR仪检测从而获得荧光扩增曲线， 之后进行扩增产物熔解温度 （Tm ） 曲线分析，由于扩增产物 GC含量差异导致Tm值不同。本文件引物可通用检测RHDV 经典型与RHDV2型靶基 因，但由于RHDV经典型扩增产物GC 含量高于RHDV2 型扩增产物，导致Tm 值明显高于后者，并依此适用于 RHDV经典型与 RHDV2型的鉴别检测。 5 试剂或材料 除非另有说明，所用试剂均为分析纯。 水：GB/T 6682 ，一级。 TRIzol试剂。 氯仿。 异丙醇。 反转录酶 M-MuLV及5×反转录酶反应缓冲液：反转录酶浓度 200 U/µL，均-20 ℃保存。 RNA酶抑制剂：50 U/ µL，-20 ℃保存。 DB37/T 4754.2 —2024 2 脱氧核糖核苷三磷酸（ dNTP）：为dATP、dGTP、dCTP、dTTP混合物，均为 10 mmol/L。 2× SYBR Green Ⅰ PCR Mix：-20 ℃保存。 75 %乙醇。 取无水乙醇 75 mL，加灭菌水至 100 mL，混匀，室温保存。 焦碳酸二乙酯（ DEPC）水。 取1 mL DEPC加入水中至1 000 mL，充分震荡混匀，静置24 h 后，121 ℃高压灭菌15 min ，4 ℃保存备 用。 磷酸盐缓冲溶液（ PBS）。 取NaCl 8 g，KCl 0.2 g，KH 2PO4 0.2 g，Na 2HPO4･12H2O 2.9 g，依次溶于 800 mL水中，用盐酸调 pH值至 7.4，定容至 1 000 mL，置于高压灭菌锅121 ℃灭菌20 min，4 ℃保存。 乙二胺四乙酸二钾（ EDTA-K2）抗凝剂。 取EDTA-K 2·2H2O 1.5 g，溶于80 mL水中，充分溶解后定容至 100 mL，置于高压灭菌锅 121 ℃灭菌20 min，室温保存。 一次性无菌注射器（ 2.5 mL）。 无核酸酶离心管 （1.5 mL）。 商品化病毒核酸提取试剂盒。 阳性对照样品和阴性对照样品。 RHDV经典型阳性对照样品为 RHDV AV34 株（购自中国兽医药品 监察所）肝组织毒， -20 ℃保存，RHDV2型阳性样品为 VP60基因体外转录的无感染性 RNA，-80 ℃保存； 阴性对照样品为 RHDV经典型、RHDV2型阴性的兔肝组织悬液， -20 ℃保存。 检测RHDV经典型与RHDV2型的通用引物。 Primer-F 5’-CAACCGGACTGTTTGTGATGGC-3 ’；Primer- R 5’-ACGCGAACATGATGGGTGTGTT- 3’。 6 仪器设备 A型Ⅱ级生物安全柜 。 电子天平：精度 0.01 g。 高速冷冻离心机：转速 ≥12 000 r/min。 微型低速离心机：转速≤ 6 000 r/min 。 冰箱：-20 ℃。 超低温冰箱： -80 ℃。 高压灭菌锅 。 荧光PCR检测仪。 7 样品 肝组织样品 病死兔的病变肝组织 样品采集、保存和运输按照NY/T 541 执行。 血液样品 活兔血液样品采集：将活兔固定，选择耳缘静脉清晰的一侧耳朵，剃毛并消毒，压迫耳根使静脉充 盈，用一次性无菌注射器（2.5 mL）针头穿刺静脉采血1.8 mL，并将新鲜血液与乙二胺四乙酸二钾抗凝 剂混合，体积比为9:1 （V:V）。血液样品保存和运输按照 NY/T 541执行。 DB37/T 475 4.2—2024 3 8 试验步骤 样品处理 8.1.1 肝脏样品 在A型Ⅱ级生物安全柜处理。 电子天平称 取1.00 g± 0.05 g样品，剪碎后加入10倍体积PBS ，充分研 磨成组织匀浆， 装入1.5 mL无核酸酶离心管中， 置高速冷冻离心机 4 ℃、12 000 r/min离心5 min，取上清 液提取核酸 。 8.1.2 血液样品 将血液样品装入 1.5 mL无核酸酶离心管中 ，-20 ℃冷冻30 min后置室温融化 5 min，反复 3次