ICS 65.020.30 CCS B 44 37 山东省 地方标准 DB37/T 4725.2—2024 动物疫病诊断技术 第2部分：α疱疹病 毒 Diagnostic techniques of animal disease —Part 2: Alpha herpes virus 2024 - 06 - 28发布 2024 - 07 - 28实施 山东省市场监督管理局 发布 DB37/T 4725.2 —2024 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件是 DB37/T 4725《动物疫病诊断技术》的第 2部分，DB37/T 4725已经发布了以下部分： —— 第2部分：α疱疹病毒。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。 本文件由山东省畜牧专业标准化技术委员会归口 。 DB37/T 4725.2 —2024 II 引言 随着国内畜牧业规模化、 集约化发展， 畜禽疫病发病率逐年上升， 疫病防控仍是现阶段的一大难题。 动物疫病的诊断作为动物疫病防控的重要组成部分，是有效控制疫病发生的先决条件。因此，针对主要 动物疫病的病原制定相应的诊断标准，有利于推动相关动物疫病的监测与管理。 DB37/T 4725《动物疫病诊断技术》是针对畜禽养殖场不同动物疫病的致病原，明确动物疫病病原 的流行特点，针对不同病原规定了特异的诊断方法和判定标准。本系列标准的制定和实施可帮助畜禽养 殖场提高主要动物疫病的诊断效率和结果准确率， 养殖场可依据诊断结果有针对性的对 发病动物实施治 疗和疫病防控，降低动物疫病的发生率，减少企业成本，提高企业经济效益，从而促进畜牧行业高质量 发展。 DB37/T 4725 拟由以下部分构成。 —— 第1部分：非洲猪瘟。目的在于指导防控山东省内规模化养猪场非洲猪瘟的诊断与防控。 —— 第2部分：α疱疹病毒。目的在于指导防控山东省内畜禽养殖场 α疱疹病毒的诊断与防控。 疱疹病毒（ herpes viruses ）是一类有包膜、基因组为双链 DNA的病毒。主要分为 α疱疹病毒、 β疱 疹病毒、 γ疱疹病毒 3种亚型。其中 α疱疹病毒对动物的危害程度最大。该病毒感染宿主广泛，包括猪、 鸡、牛、马和驴等，在国内外均有分布。 DB37/T 4725.2 —2024 1 动物疫病诊断技术 第2部分：α疱疹病毒 1 范围 本文件规定了猪伪狂犬病，鸡马立克氏病，牛传染性鼻气管炎和马鼻肺炎的流行特点和诊断方法。 本文件适用于猪、鸡、牛、马、驴 α疱疹病毒的流行病学调查、诊断和检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日 期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 流行特点 猪伪狂犬病 4.1 由猪伪狂犬病毒（ Porcine pseudorabies virus ，PRV）感染猪引起的一种急性传染病。猪是伪狂 犬病毒的贮存宿主，患病猪、带毒猪以及带毒鼠类为主要传染源。本病主要通过空气传播，同时，在猪 群中也存在鼻分泌物传播的现象。该病呈季节性流行，常发生在寒冷的季 节。 鸡马立克氏病 4.2 由鸡疱疹病毒 2型（Gallid Alphaherpesvirus 2 ，GaHV-2），即马立克氏病病毒（ Marek’s disease virus，MDV）感染鸡引起的一种淋巴细胞增生性疾病。病鸡和带毒鸡是主要传染源。本病主要通过空气 传播，另外，污染的饲料和饮水，以及饲养人员流动也可传播该病。 2月龄～5月龄的鸡常发。 牛传染性鼻气管炎 4.3 由牛疱疹病毒 1型（Bovine herpesvirus 1 ，BoHV-1）感染牛引起的一种接触性传染病。病牛和带 毒牛是主要传染源，该病主要由飞沫经呼吸道传播，另外，也可通过生殖道黏膜、眼结膜传播。常发生 于秋、冬寒冷季节。 马鼻肺炎 4.4 由马疱疹病毒 1型、4型或8型（Equine herpesvirus type ，EHV-1/4/8）感染马属动物引起的一种 急性、热性传染病。病马或驴和恢复后带毒的马或驴是主要传染源。该病主要通过呼吸道传播，另外， 部分带毒的公马或驴可通过交配传播。该病多发生于秋冬和早春。 DB37/T 4725.2 —2024 2 5 诊断 临床诊断 5.1 5.1.1 猪伪狂犬病 潜伏期一般为 2 天～6 天，刚配种的母猪发病时易出现隐形流产；母猪发病早期无显著症状，妊娠 母猪分娩前或后 1周出现食欲下降甚至废绝，且出现早产，流产，产死胎或弱胎；公猪出现睾丸萎缩， 阴囊肿大，精子活力低。哺乳仔猪感染以后出现高热，抽搐，震颤和共济失调等神经症状。 5.1.2 鸡马立克氏病 潜伏期一般 3周～4周，根据疱疹病毒侵害部位不同，分为四种类型。 5.1.2.1 神经型：患病鸡出现站立不稳，呈“劈叉”姿势，翅膀下垂，低头或斜颈等为典型症状。 5.1.2.2 内脏型：常见于 50日龄～70日龄的鸡，病鸡精神萎顿，食欲减退，消瘦，羽毛松乱，鸡冠 苍白或黑紫色、皱缩，伴有黄白色或黄绿色下痢，常因脱水导致死亡。 5.1.2.3 眼型： 病鸡出现瞳孔缩小， 虹膜边缘不整齐，颜色常为灰白色。 轻者对光线强度的反应迟钝， 重者失明。 5.1.2.4 皮肤型：病鸡常出现毛囊肿大或皮肤结节。 5.1.3 牛传染性鼻气管炎 潜伏期7 天左右，根据疱疹病毒侵害部位不同，分为四种类型。 5.1.3.1 呼吸道型： 病牛体温升至 40 ℃以上，鼻黏膜充血， 出现散发性小脓疱， 伴随咳嗽、 呼吸困难、 咽下障碍。 5.1.3.2 结膜角膜炎型：病牛出现结膜和角膜充血，眼睑肿大，流泪，角 膜浑浊，有坏死性斑点。 5.1.3.3 生殖器型：病母牛体温升高，精神沉郁，食欲废绝，外阴肿胀有小脓疱；出现子宫炎导致流 产，产死胎。公牛感染出现传染性脓疱型包皮龟头炎，丧失配种能力。 5.1.3.4 脑膜炎型：以 6月龄以内的犊牛易发，体温升高，出现惊厥，共济失调，角弓反张等现象。 5.1.4 马鼻肺炎 潜伏期2 天～10 天，马属动物出现鼻肺炎，孕畜流产，以及神经症状等。患病初期体温升高，流鼻 液，鼻黏膜，眼结膜充血，下颌淋巴结肿大，同时血液中白细胞数量明显减少，感染严重者因呼吸困难 而死亡。孕马或孕驴出现流产，或驴驹死亡。以 1岁～2岁马或驴多发， 3岁后呈隐性感染。 实验室诊断 5.2 5.2.1 猪伪狂犬病 5.2.1.1 样品采集 按照NY/T 541 规定，采集患病猪的鼻拭子、血液、肺 脏、淋巴结、脑和扁桃体等组织。 5.2.1.2 聚合酶链式反应（ PCR）检测与电泳分析 鉴于PRV的检测需要鉴别是野毒感染还是疫苗毒，取 200 μL鼻拭子或病料组织的上清液借助商品化 试剂盒制备 DNA，以DNA为模板，借助特异性引物分别进行 PCR扩增（引物序列见表 1，其中gE引物用于野 毒鉴别， gB引物用于常规检测），具体操作步骤按照附录 A规定执行。目的片段大小为 368 bp或480 bp。 DB37/T 4725.2 —2024 3 表1 普通PCR引物信息 名称 序列（5’→ 3’） 片段大小 PRV-gE-F TTTGGATCCATGCGGCCCTTTCTG 368 bp PRV-gE-R TTTGAATTCTTACGACACGGCGTCGCA PRV-gB-F AGGTGTCGTTGGTGGTGT 480 bp PRV-gB-R ACGGCGACCTGGACG 5.2.1.3 实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）检测 鉴于PRV的检测需要区分野毒感染还是由疫苗免疫造成，以 5.2.1.2纯化的DNA为模板，利用特异性 引物分别进行 PCR检测（引物序列见表 2，gE引物用于鉴别野毒， gB引物用于常规检测）， qRT-PCR具体 操作步骤按照附录 B规定执行。 表2 荧光定量 PCR引物信息 名称 序列（5’→ 3’） 片段大小 qPRV-gE-F CTGTACGTGCTCGTGATGAC 96 bp qPRV-gE-R CTCCTTGRTGACCGTGACG qPRV-gB-F GTCCGTGAAGCGGTTCGTGAT 95 bp qPRV-gB-R ACAAGTTCAAGGCCCACATCTAC 5.2.1.4 野毒分离与检测 分析核酸电泳结果，或 qRT-PCR结果，选取判定为猪伪狂犬病毒阳性的脑，肺脏或淋巴结等病料借 助研磨仪匀浆后，经反复冻融 3次后，5 000 rpm 离心10 min。收集上清借助 0.22 μm滤膜除菌后，接种 至猪肾细胞（ PK-15）中，同时添加 1 000 IU/mL青霉素和 1 000 μg/mL链霉素，设置空白对照组