ICS 65.020.30 CCS B 44 37 山东省 地方标准 DB37/T 4724—2024 驴驹大肠杆菌病防治技术规程 Code of practice for the prevention and treatment of colibacillosis in donkey foals 2024 - 06 - 28发布 2024 - 07 - 28实施 山东省市场监督管理局 发布 DB37/T 4724 —2024 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。 本文件由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 DB37/T 4724 —2024 1 驴驹大肠杆菌病防治技术规程 1 范围 本文件规定了驴驹大肠杆菌病的流行病学、临床症状、病理变化、诊断、预防、治疗、病死驴及病 害驴处理和档案管理。 本文件适用于养驴场驴驹大肠杆菌病的防治。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 19489 实验室生物安全通用要求 GB 39707 医疗废物处理处置污染控制标准 NY/T 388 畜禽场环境质量标准 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 NY 5027 无公害食品 畜禽饮用水水质 NY/T 5030 无公害农产品 兽药使用准则 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 驴驹大肠杆菌病 donkey foals colibacillosis 3.2 由O78、O101、O8等主要血清型的致病性大肠杆菌引起驴驹的急性、接触性传染病。 注： 病例特征呈现剧烈的下痢和败血症症状。 4 流行病学 病原特点 4.1 病原为肠杆菌科大肠埃希氏菌属中 O78、O101、O8等主要血清型的致病性大肠杆菌。病原菌为革兰氏 阴性菌，在驴驹肠道及其粪便污染的环境中广泛存在。 传染源 4.2 发病驴驹和携带致病性大肠杆菌的驴。 传播途径 4.3 该病通过消化道传播，粪 -口传播是主要途径。病原菌污染粪便、圈舍、饲料、水槽及饮水等均可 传播。可通过脐带或分娩时经产道传播。 DB37/T 4724 —2024 2 易感动物 4.4 8月龄内的驴驹均可发病，多于出生后 2 d～3 d发病。 发病特点 4.5 一年四季均可发生，以冬末初春季节交替时段多发，潜伏期为 1 d～2 d。发病率为 5%～40%，病死率 为2%～20%。 5 临床症状 驴驹发病初期体温升高，精神沉郁，食欲不振，粪便粥样或水样，剧烈腹泻，肛门失禁，排出液状 粪便，呈黄色、白色或灰白色，有时含多量黏液或血液，腥臭味。发病中期出现衰弱，脱水，喜躺卧， 无法站立。发病末期，食欲废绝，腹泻和便秘交替发生，由败血症和全身微循环衰竭致死。 6 病理变化 胃黏膜脱落，有出血点和出血斑。小肠、盲肠和结肠表现为黏膜脱落。肝脏肿大、淤血。脾肿大， 包膜下有出血点。心内膜和外膜也有出血点，肠系膜淋巴结肿大、出血。 7 诊断 临床诊断 7.1 驴驹出现腹泻或败 血症等症状可假定大肠杆菌感染，根据流行病学、临床症状和病理变化等做出初 步临床诊断。 实验室诊断 7.2 见附录A。 7.2.1 采样 按NY/T 541 的规定执行，主要采集肛拭子、腹泻物等病料。 7.2.2 细菌分离培养 无菌取病料，经三区划线接种于麦康凯培养基上， 37 ℃恒温培养 24 h，培养出表面光滑、粉红色圆 形菌落。挑取符合大肠杆菌特征的单菌落纯化 3次～4次。 7.2.3 显微镜检 将单菌落革兰氏染色，镜检，油镜下呈现两端钝圆，单在或成对的革兰氏阴性菌。 7.2.4 生化鉴定 将纯化后的细菌接种 于葡萄糖、甘露醇、乳糖、麦芽糖、吲哚试验、 V-P试验、甲基红试验、枸橼 酸盐试验管， 37 ℃恒温培养 24 h后观察。 结果显示： 葡萄糖产酸产气、 甘露醇产酸产气、 乳糖产酸产气、 麦芽糖产酸产气、吲哚试验和甲基红试验呈阳性， V-P试验和枸橼酸盐试验呈阴性。 7.2.5 大肠杆菌 O血清型鉴定 DB37/T 4724 —2024 3 将纯化的大肠杆菌接种于 LB固体培养基上， 37 ℃培养24 h，用0.5%石炭酸生理盐水洗下菌苔，制成 浓稠悬液，经 121 ℃高压2 h，制备O抗原。取洁净玻片，吸取 O抗原滴于玻片两端，一滴加入 10 μL抗O 血清，一滴加入等量生理盐水。轻轻晃动玻 片，倾斜玻片 30°于1 min内观察试验现象。按照表 A.1进行 判定，出现“ ++”及以上凝集反应判定阳性结果。 7.2.6 分离菌株 16S rDNA 序列测定 提取分离菌基因组 DNA为模板扩增 16S rDNA 序列。引物序列按照 附录A。PCR反应体系为模板（基因 组DNA20 ng/μL～50 ng/μL）2 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上下游引物（ 20 μmol/L）各 1 μL，ddH2O 8.5 μL，共25 μL反应体系。 PCR反应程序为 95 ℃预变性 5 min；95 ℃变性15 s，53 ℃退 火15 s，72 ℃延伸2 min，共30个循环；最终 72 ℃延伸5 min，4 ℃暂时保存。通过 1%琼脂糖凝胶电泳鉴 定。片段大小约为 1 500 bp。回收并纯化 PCR产物，按照双 脱氧链终止法测序。 结果判定 7.3 将PCR测序结果使用 NCBI中的BLAST进行检索，是否与数据库序列一致。应根据临床诊断和实验室诊 断结果确诊该病。 实验室生物安全 7.4 按照GB 19489 规定执行。 8 预防 环境卫生 8.1 按NY/T 388 和NY 5027的规定执行。夏季食槽和水槽应及时清理。 生物安全 8.2 生产区内不得饲养其他动物， 不应屠宰和解剖病死驴， 不带入其他畜产品。 料库应有防鼠防鸟设施。 管理 8.3 8.3.1 妊娠母驴 做好孕驴产前和产后护理工作 , 将临产母驴提前转入消毒好的专用产舍。接产人员应消毒。产后及 时清理胎衣和其它排泄物并彻底消毒。寒冷季节做好产房保温。 8.3.2 驴驹 产后及时做好驴驹脐部消毒工作。 驴驹吸吮初乳前， 对乳区进行消毒， 确保新生驴驹吃到足够初乳。 驴驹断奶前应提前做好补料，预防断奶应激。驴驹设置独立圈舍，并保持圈舍干燥、清洁。秋冬季新生 驴驹应做好保暖工作。 预防措施 8.4 根据流行病学调查结果，发病率高驴场，在分娩前 3 d～5 d给予母驴微生态制剂或中兽药。 9 治疗 DB37/T 4724 —2024 4 原则 9.1 9.1.1 口服、注射方式投入兽药应符合 NY/T 5030 的要求。 9.1.2 抗菌药物的使用应根据实验室药敏试验结果，科学规范使用。 方法 9.2 采用对因治疗和对症治疗。推荐药物 见附录B。 10 病死驴及病害驴处理 病死驴及病害驴的处理见《病死及病害动物无害化处理技术规范》（农医发 [2017]25 号）的规 10.1 定。 废弃物与病料处理按照 GB 39707 规定执行。 10.2 11 档案管理 记录 11.1 记录应统一、规范。记录内容包括驴的年龄，发病时间及症状、药品使用、药品的生产厂家、生产 日期、剂量、疗程、消毒、免疫、实验室检测结果、疗效及停药时间。 存档 11.2 各种记录保存期限不低于两年，分类归档。 DB37/T 4724 —2024 5 A A 附录 A （规范性） 主要实验室诊断方法 A.1 原理 A.1.1 麦康凯选择培养基：大肠杆菌发酵乳糖产酸， PH值降低，麦康凯平板中的显色剂（中性红）显 红色，同时有胆盐沉淀呈现粉色。 A.1.2 革兰氏染色： G+菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水 而孔障缩小，故保留结晶紫 -碘复合物在细胞膜上。呈紫色。 Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高，乙醇将脂溶解，缝隙 加大，结晶紫 -碘复合物溶出细胞壁，沙黄复染后呈红色。 A.1.3 大肠杆菌 O血清型鉴定：通过抗原与抗体的相互作用，使得抗原或抗体在一定条件下发生凝集现 象，抗体是机体对抗原的特异性免疫应答产生的一种蛋白质，它可以与抗原结合形成免疫复合物。当抗 原与抗体结合时，它们之间的亲和力会导致免疫复合物的形成，从而引起凝集反应。 A.1.4 PCR反应：聚合酶链反应（ PCR）是80年代中期发展起来的分子生物 学技术。其基本原理是用两 段人工合成的寡核苷酸片段为引物，以双链或单链 DNA为模板，在 DNA聚合酶作用下，经过反复多个循环 的变性、复性、延伸等对特定的核酸片段进行扩增，这一方法稳定，能在很短的时间内扩增，得到大量 所需要的特异性 DNA片段，而且扩增的片段