ICS 11.220 CCS B 41 35 福建省地方标准 DB35/T 2024 —2021 鳗鲡疱疹病毒感染诊断技术规范 Protocol of diagnosis technology for Herpesvirus anguillae infection 2021 - 11 - 23 发布 2022 - 02 - 23 实施 福建省市场监督管理局 发布DB35/T 2024 —2021 I 目次 前言 ............................................................ ..................... II 1 范围 ......................................................... ...................... 1 2 规范性引 用文件 .................................................... ................. 1 3 术语和定 义 ...................................................... ................... 1 4 缩略语 ........................................................ ..................... 1 5 主要试剂 和材料 .................................................... ................. 1 6 主要仪器 和设备 .................................................... ................. 2 7 临床诊断 ....................................................... .................... 2 8 实验室分 子诊断 .................................................... ................. 2 9 综合判定 ....................................................... .................... 3 附录 A（资料性） 试剂配制 ............................................................. 4 附录 B（资料性） 鳗鲡疱疹病毒阳性参考序列 ............................................. 6 DB35/T 2024 —2021 II 前言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由福建省农业科学院提出。 本文件由福建省海洋与渔业局归口。 本文件起草单位：福建省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所、福建省农业科学院生物技术 研究所、福州海关技术中心、清流县畜牧兽医水产中心。 本文件主要起草人：饶秋华、葛均青、张志灯、罗土炎、黄文华、杨金先、刘洋、何肖云、陈强、 宋铁英、罗钦、黄薇。DB35/T 2024 —2021 1 鳗鲡疱疹病毒感染诊断技术规范 1 范围 本文件规定了日本鳗鲡 （ Anguilla japonica ） 、 欧洲鳗鲡 （ A. anguilla ） 、 美洲鳗鲡 （ A. rostrata ） 、 花鳗鲡（ A. marmorata ）及太平洋双色鳗鲡（ A. bicolor pacifica ）的鳗鲡疱疹病毒感染诊断技术。 本文件适用于鳗鲡疱疹病毒感染的诊断。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（Cetyltrithyl ammonium bromide） dATP：脱氧腺苷三磷酸（Deoxyadenosi ne tripho sphate） dCTP：脱氧胞苷三磷酸（Deoxycytidin e triphosphate） dGTP：脱氧鸟苷三磷酸（Deoxyguanosi ne tripho sphate） DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid） dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（Deoxy-ri bonucleosid e triphosphate） dTTP：脱氧胸苷三磷酸（Deoxythymidi ne tripho sphate） EB：溴化乙啶（Ethidium bromide） EDTA：乙二胺四乙酸（Ethylene diam inetetraace tic acid） HVA：鳗鲡疱疹病毒（ Herpesvirus anguillae ） PCR：聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction） Taq 酶：DNA 聚合酶（Thermus Aquati cus DNA Polymerase） TBE：三羟甲基氨基甲烷-硼酸-乙二胺四乙酸（Tris -borate-EDTA） Tris：三羟甲基氨基甲烷（Tris hyd roxymethyl am inomethane） 5 主要试剂和材料 5.1 水：应符合 GB/T 6682 中一级水的规定。 5.2 Taq 酶：2 U/ μL，﹣20 ℃保存。 DB35/T 2024 —2021 2 5.3 dNTP：dCTP、dGTP、dATP、dTTP，浓度为2.5 mmol/L。 5.4 引物：上游引物 H V A - F：5 ’-GTGTCGGGCCTTTGTGGTGA-3 ’，下游引物 H V A - R： 5’-CATGCCGGGAGTCTTTTTGAT-3 ’，引物浓度为 10 μmol/L。 5.5 琼脂糖：电泳级。 6 主要仪器和设备 6.1 恒温培养箱：温度误差±2 ℃。 6.2 高速离心机：12 000 g以上。 6.3 PCR 仪。 6.4 水平电泳仪。 6.5 凝胶成像仪。 6.6 匀浆器。 7 临床诊断 7.1 体表检查 观察鱼体是否出现下列症状：体表出现黏液脱落，鳃盖、颌部、胸鳍和腹鳍等部位出现瘀血和出血， 尤其头部鳃盖和颌部出血、淤血明显，体表或形成明显脱黏斑。 7.2 解剖检查 解剖病鱼，观察是否出现下列症状：鳃红肿出血；肝脏肿大，有出血点和灰白色的坏死病灶；脾脏 和肾脏肿大、出血；肠粘膜水肿、充血、发炎。 7.3 临床判定 体表检查和解剖检查中出现以上临床症状，初步判断为疑似鳗鲡疱疹病毒感染。 8 实验室分子诊断 8.1 鳗鲡疱疹病毒的 PCR检测 8.1.1 采样 在鳗鲡的鳃、肝脏、脾脏、肾脏等部位及体表黏液，共取50 mg～10 0 mg样品，置于1.5 mL离心管 中。 8.1.2 样品处理 首先加入150 μL CTAB溶液（见附录A的A.1），用小剪刀将样品剪碎，再用匀浆器将样品匀浆后， 再加CTAB溶液到900 μL，混匀后于室温孵育2 h，4 000 g离心5 min，取上清液。 8.1.3 DNA抽提 在上述上清液中先加600 μL抽提液1（见附录A的A.2），充分混合30 s，12 000 g离心5 min，取上 层水相；再加700 μL抽提液2（见附录A的A.3），充分混合30 s，12 000 g离心5 min，取上层水相；然 后加入1.5倍体积的异丙醇，混匀后，静置5 min，12 000 g离心10 min，弃上清液；加入600 μL 75%DB35/T 2024 —2021 3 乙醇，混匀后12 000 g离心10 m in，弃上清液，室温静置5 min；最后加20 μL水溶解沉淀，作为PCR模 板。提取步骤也可采用等效商品化组织DNA提取试剂盒提取。 8.1.4 PCR 扩增 DNA 在0.2 mL离心管中加入10×PCR缓冲液（见附录A的A.7）2.5 μL、25 mmol/L氯化镁（MgCl 2）（见 附录A的A.6）1 μL、dNTP 2 μL、上下游引物各0.5 μL、Taq酶2 U、1 μL待测样品DNA为模板，补充水 至总体积25 μL，也可采用等效商品化试剂盒进行扩增。 反应液混匀后，离心使其集中在离心管底部，将离心管置于PCR扩增仪，按照94 ℃ 4 min；再 94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40次循环；然后72 ℃ 10 min；最后4 ℃保温的反应条件进 行 PCR扩增。 8.1.5 琼脂糖凝胶电泳 用TBE电泳缓冲液（见附录A的A.4）配制1%的琼脂糖[含0.5 μg/mL