ICS 11.220 CCS B 41 34 安徽省地方标准 DB34/T 4950 —2024 禽白血病—通用/A/J三重PCR检测 技术规程 Technical regulation for generic/A/J tr iple PCR detection for avian leukemia 2024 - 09 - 14 发布 2024 - 10 - 14 实施 安徽省市场监督管理局 发布 DB34/T 4950 —2024 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由安徽省动物疫病预防与控制中心提出。 本文件由安徽省农业农村厅归口。 本文件起草单位：安徽省动物疫病预防与控制中心、安徽农业大学动物科技学院、滁州市动物疫病 预防与控制中心、宣城市动物防疫站、宁国市动物卫生监督所。 本文件主要起草人：沈艳、江定丰、郑举、季晶晶、王立、陈芳芳、何长生、程帮照、王维、范亚 楠、王倩、王军、苗文萍、段倩倩、刘畅、陆平、陈曦、周迎春、刘华、陈静、朱良强、伍唯。 DB34/T 4950 —2024 1 禽白血病-通用/A/J 三重 PCR 检测技术规程 1 范围 本文件规定了禽白血病-通用/A/J三重PCR检测方法的主要仪器设备、试剂、引物、反应条件、试验 步骤、结果判定。 本文件适用于禽白血病病毒、A亚群和J亚群的三重PCR检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 Bp：碱基对（base pair） DNA：脱氧核糖核酸( deoxyrib onucleic acid) DEPC：焦炭酸二乙酯（diethypyrocarbonate） PBS：磷酸盐缓冲盐水（phosphate buffered saline） ALV：禽白血病病毒（avian le ukemia virus） RNA：核糖核酸（ribon ucleic acid） RT-PCR；反转录聚合酶链反应（reverse tr anscription-p olymerase chai n reactio n） 5 主要试剂 本文件所用试剂均为分析纯，所用水应符合 GB/T 6682 中一级水的规格，所有试剂均用无 RNase 污染的容器分装。 商品化的 RNA 提取裂解液。 PBS 液，按照附录 A.1配制。 TRIzol RNA提取试剂或其他商品化的基因组 RNA 提取试剂盒。 氯仿。 异丙醇（-20℃预冷）。 DB34/T 4950 —2024 2 DEPC 水：在100 mL 三蒸水中加入 100 μL DEPC，18℃～22℃室温下过夜，121℃灭菌15 min。也 可用商品化的产品。 75％乙醇：75 mL 无水乙醇加 25 mL DEPC 水，配置成 75％乙醇溶液，-20℃遇冷备用。 商品化的反转录试剂盒。 2×Fast Taq premix：商品化试剂盒。 50×TAE 电泳缓冲液，见附录 A.2。 1.5％琼脂糖凝胶，见附录 A.3。 DNA 分子量标准：DL 2000 Marker,商品化试剂 电泳上样缓冲液：100 mL 溶液中含0.25 g 溴酚蓝及 40 g 蔗糖。 引物，引物对序列见附录 B.1，加 DEPC 水制成 100 μmol/L 的储存浓度和 10 μmol/L 的工作浓 度。 阴性对照，健康鸡血液或者组织提取的 DNA/RNA。 阳性对照，为 A 和J 亚群禽白血病病毒基因组 DNA/RNA。 6 仪器和设备 PCR 仪。 台式高速冷冻离心机（4℃，离心速度 12000 r/min 以上）。 稳压稳流电泳仪和水平电泳槽。 凝胶成像系统。 可调微量移液器（规格 100 μL～1000 μL、20 μL～200 μL、1 μL～20 μL）以及无 RNase 污染带 滤芯吸头。 组织研磨器。 7 样品的采集、运输与保存 按照 NY/T 541 的规定执行。 8 实验步骤 样本制备 8.1.1 全血、血浆或精液 直接使用。 8.1.2 组织样本 取待检组织样本于灭菌的组织研磨中，按质量体积比 1：1 加入灭菌 PBS，充分研磨，制备组织匀 浆，4℃，3000 r/min 离心 1 5 min，取上清液转入无菌的 1.5 mL 离心管中，对样本进行编号。 RNA 的提取 8.2.1 取灭菌的 1.5 mL 无RNA 酶的离心管，编号。 8.2.2 TRIzol 试剂提取待检样品、阴性对照及阳性对照样品的 RNA。 8.2.3 100 μL 8.1中的制备样本，900 μLTRIzol 置入1.5 mL 无 RNA酶的离心管，振荡 5 次至 10 次，DB34/T 4950 —2024 3 静置 5 min。 8.2.4 加入 200 μL 氯仿，振荡混匀，室温放置 5 min，4℃ 120 00 r/min，离心 15 min。 8.2.5 吸取上层水相至一新的 1.5 mL 无RNA 酶的离心管中，加入等体积异丙醇（－20℃预冷），混 匀，室温放置 5 min，4℃ 12000 r/min，离心 15 min。 8.2.6 弃去上清， 加入1 mL 75％乙醇 （DEPC 水配制） ，缓慢颠倒以漂洗沉淀及管壁， 4℃ 12000 r/min， 离心 15 min。 8.2.7 倒去上清，加入置室温条件下干燥后，加适量（通常为 20 μL～30 μL）DEPC 水溶解。 8.2.8 提取的 RNA应尽快进行 RT-PCR 扩增。若需长期保存，应放置 －70℃冰箱。 8.2.9 也可以采用质量相当的商品化基因组RNA提取试剂盒进行待检样品、 阴性和阳性对照样品的RNA 提取，按照试剂盒说明书进行操作。 反转录（RT） 参照反转录试剂盒说明操作。 PCR 扩增 将表1 中的试剂充分混匀，4000 r/min 离心 30 s。 PCR的反应条件：98℃预变性 10 s、95℃变性 30 s、53℃退火 30 s、72℃延伸 30 s、35 个循 环，72℃终延伸 8 min 扩增反应结束后，进行扩增产物的琼脂糖凝胶电泳。 表1 PCR 反应体系（总体积为 20 μL） 组分 体积 /μL 2×Fast Taq premix 10.0 ALV-pol-F（10 μmol/L） 1.0 ALV-pol-R（10 μmol/L） 1.0 ALV-A-F（10 μmol/L） 1.5 ALV-A-R（10 μmol/L） 1.5 ALV-J-F（10 μmol/L） 0.5 ALV-J-R（10 μmol/L） 0.5 模板 1.0 DEPC水 3.0 总量 20.0 琼脂糖凝胶电泳 制备 1.5％的琼脂糖凝胶板（参见附录A.3），取 5.0 μL PCR产物和 1.0 μL 电泳上样缓冲液混 合后，分别加样到凝胶孔中。100 V 恒压下电泳 15～20 min，在凝胶成像系统上观察并拍照记录。 9 结果判定 试验成立条件：阳性对照在 338bp、274bp、145bp 位置同时出现特异性扩增条带；阴性对照无任 何特异扩增条带。 DB34/T 4950 —2024 4 被检样本 338bp、274bp、145bp 位置同 时出现特异性扩增条带，判定 ALV核酸阳性、ALV-A、ALV- J 亚群核酸阳性。 被检样本 338bp、 145bp 位置同时出现特异性扩增条带， 判定 ALV 核酸阳性、 ALV-A 亚群核酸阳性。 被检样本 274bp、 145bp 位置同时出现特异性扩增条带， 判定 ALV 核酸阳性、 ALV-J 亚群核酸阳性。 被检样本仅 145bp 位置出现特异性扩增条带，判定 ALV 核酸阳性。 被检样本无特异性扩增条带，判定 ALV 阴性。 注： 必要时，可取RT-PCR扩增产物进行序列测定，并与已公开发表的ALV特异性片段进行同源性比对分析，以确证检 测结果。