ICS 13.160.20 CCS X 04 34 安徽省 地方 标准 DB34/T 4878—2024 包装饮用水中铜绿假单胞菌快速检测 胶体金免疫层析法 Rapid detection of Pseudomonas aeruginosa in packaged drinking water —Colloidal gold immunochromatographic assay 2024 - 07 - 30发布 2024 - 08 - 30实施 安徽省市场监督管理局 发布 .DB34/T 4878 —2024 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 -2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由安徽省产品质量监督检验研究院提出。 本文件由安徽省市场监督管理局归口。 本文件起草单位：安徽省产品质量监督检验研究院、安徽省食品药品检验研究院、安徽蓝蓝矿泉水 有限公司。 本文件主要起草人：陈赵然、姚帮本、郭佳佳、吴基杰、郑健、陈伟、闫超、刘玉军、童宁、朱双 四、徐建国、叶应旺、张居舟、程潇、郭佳、孟宪卓、周裔彬、祝红蕾、张静、姜采妮、候永成、陈方 圆、徐丽娜、章颖、谢晶、郭婷。 DB34/T 4878 —2024 1 包装饮用水中铜绿假单胞菌快速检测 胶体金免疫层析法 1 范围 本文件规定了包装饮用水中铜绿假单胞菌的胶体金免疫层析快速检测方法。 本文件适用于包装饮用水中铜绿假单胞菌的快速检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 8538 食品安全国家标准 饮用天然矿泉水检验方法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 原理 样品中的铜绿假单胞菌经滤膜过滤富集，超声处理提取 DNA，以此为模板，设计经异硫氰酸荧光素 （FITC）和生物素（ biotin）修饰的上下游引物，通过聚合酶链 式反应（ PCR）得到扩增产物。扩增产 物的FITC端与胶体金上的 FITC抗体结合， biotin端与试纸条检测线 （ T线） 上的链霉亲和素 （ SAV） 结合， 导致T线颜色加深，通过 T线与控制线（ C线）颜色比较，对样品中的铜绿假单胞菌进行定性判定。 5 试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯。 水：试验用水符合 GB/T 6682 中一级水的要求。 铜绿假单胞菌标准菌株 ：CMCC（B）10282 或等效标准菌株。 三羟甲基氨基甲烷（ Tris）。 浓盐酸（ HCl）。 乙二胺四乙酸二钠（ EDTA-2Na•2H2O）。 氢氧化钠溶液（ NaOH）。 Tris-HCl溶液：称取Tris（5.3）6.06 g，加水（ 5.1）40 mL溶解，调 pH至8.0，加水（ 5.1） 定容至50 mL。 EDTA溶液：称取EDTA-2Na•2H2O（5.5）9.306 g， 加水 （5.1）35 mL， 充分溶解， 用 NaOH溶液（5.6） 调pH至8.0，加水（ 5.1）定容至 50 mL。 DB34/T 4878 —2024 2 TE缓冲溶液 ：量取 1 mL Tris-HCl溶液（5.7）于100 mL容量瓶中，再加入 0.2 mL EDTA（5.8） 溶液，加水（ 5.1）定容至 100 mL。4 ℃保存，有效期一年。 PCR预混液：主要成分为 DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸（ dNTP）、氯化镁（ MgCl 2）。 无菌双蒸水（ ddH2O）。 上样缓冲液 ：主要成分为 Tris-HCl溶液、柠檬酸钠缓冲液、吐温 20、聚乙二醇 20000。 营养肉汤 ：主要成分为蛋白胨、牛肉粉、氯化钠、葡萄糖。 铜绿假单胞菌菌悬液 ：用接种环挑取平皿上培养 20 h～ 24 h的铜绿假单胞菌标准菌株（ 5.2） 典型菌落，接种到营养肉汤（ 5.13）中，37℃±1℃培养 18 h～ 20 h，至活菌数达到 1×108 CFU/mL～ 5×108 CFU/ mL时，即制得铜绿假单胞菌菌悬液。 引物：上 游 引 物 5’-Biotin-GGCATTCAGATTGCTGCTCG -3’，下 游 引 物 5’-FITC-ACCGCCGTCAGAATCAGTTT -3’。 6 仪器和设备 PCR仪。 过滤装置。 微量移液器。 旋涡混合器 。 超声波水浴仪。 电子天平：感量 分别为 0.01 g和0.001 g。 无菌滤膜： 直径 47 mm，微孔径为 0.45 μm。 离心管。 离心机：离心转速≥ 5000 rpm 。 pH计。 胶体金免疫层析检测试纸条。 胶体金读卡仪（可选） 。 7 检测 样品处理 将 250 mL待检水样通过孔径 0.45 μm的无菌滤膜（6.7）过滤，滤膜备用 。以无菌水作为空白对 照，以铜绿假单胞菌菌悬液（ 5.14）作为阳性质控对照。 DNA提取 将7.1得到的滤膜置于 无菌瓶底部，加入 1 mL的 TE 缓冲溶液 （5.9）重悬，超声后将 瓶中溶液 转移 到 1.5 mL离心管中， 5000 rpm 室温离心 5 min，取上清液 备用。 PCR扩增 取7.2得到的上清液 2 μL，加入PCR预混液（ 5.10）12.5 μL，10 μmol/L上下游引物 （5.15）各 0.8 μL，ddH2O（5.11）8.9 μL。混匀后进行 PCR扩增，扩增条件为： 95 ℃预变性5 min；94 ℃变性 30 s， 61 ℃退火30 s， 72 ℃延伸30 s，共 35 个循环； 72 ℃再延伸 2 min，得到扩增 产物，备用。 测定 DB34/T 4878 —2024 3 取7.3得到的扩增产物 2 μL，滴加在 胶体金免疫层析检测试纸条（ 6.11）上，再滴加 48 μL上样 缓冲液（5.12）于样品垫上，静置 3 min，观察T线和C线显色情况，进行结果判定 。 8 结果判定 无效 控制线（ C线）不显色 ，或空白试验检测线（ T线）显色，或阳性质控试验检测线（ T线）不显色， 均判定无效。示意图见图 1。 阴性 控制线（ C线）显色，检测线（ T线）不显色。 阳性 控制线（ C线）与检测线（ T线）均显色。 参比标准 检测结果为阳性时可采用参比标准 GB 8538 进行确认 。 图1 目视判定示意图 9 性能指标 检出限 检出限为 1 CFU/250 mL。 灵敏度 灵敏度≥95%。 DB34/T 4 878—2024 4 特异性 特异性≥95%。 假阴性率 假阴性率 ≤5%。 假阳性率 假阳性率 ≤5%。 定性方法 性能指标计算方法 见附录 A。