ICS62.020.20 CCSB62 3211 镇江市地方标准 DB3211/T1099—2024 多年生异担子菌检验技术规程 CodeofpracticeforexaminationofHeterobasidionannosum 2024-12-30发布 2025-02-01实施 镇江市市场监督管理局  发布DB3211/T1099—2024 I目次 前言..................................................................................II 1范围.................................................................................1 2规范性引用文件.......................................................................1 3术语和定义...........................................................................1 4检验流程.............................................................................1 5症状.................................................................................2 6仪器设备、试剂和培养基...............................................................2 6.1仪器设备.........................................................................2 6.2试剂.............................................................................2 6.3培养基...........................................................................2 7采样.................................................................................2 8核酸制备和扩增反应...................................................................2 8.1核酸的制备.......................................................................2 8.2引物序列.........................................................................2 8.3扩增反应体系.....................................................................2 8.4扩增反应条件.....................................................................3 9结果判定.............................................................................3 10结果记录、资料保存与复核............................................................3 附录A（资料性）多年生异担子菌相关资料.................................................4 A.1子实体...........................................................................4 A.2菌丝结构.........................................................................4 A.3菌肉.............................................................................4 A.4菌管.............................................................................4 A.5孢子.............................................................................4 A.6分布及主要特征...................................................................5 附录B（资料性）多年生异担子菌样本鉴定报告.............................................6DB3211/T1099—2024 II前言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由江苏农林职业技术学院提出。 本文件由镇江市农业农村局归口。 本文件起草单位：江苏农林职业技术学院、北京林业大学、镇江海关。 本文件主要起草人：陈佳佳、孙亚亚、员瑗、于健、戴玉成、崔宝凯、曹书培、郑香容、付丹阳、 彭金凤、李松、黄晓潇、吴项乾、莫家兴、邱秀文、杨洪俊。DB3211/T1099—2024 1多年生异担子菌检验技术规程 1范围 本标准确立了多年生异担子菌检验流程，规定了该病菌症状、采样、核酸制备、等温扩增反应、和 结果判定等各阶段操作要求。 本标准适用于进出境松、柏属植物材料中携带多年生异担子菌的检验。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 SN/T2589植物病原真菌检测规范 3术语和定义 3.1多年生异担子菌（Heterobasidionannosum(Fr.)Bref.）属于担子菌门（Basidiomycota），伞 菌纲（Agaricomycetes），红菇目（Russulales），刺孢多孔菌科（Bondarzewiaceae），异担子 菌属（Heterobasidion）。 4检验流程 多年生异担子菌具体检验流程见图1。 图1检验流程图DB3211/T1099—2024 25症状 该病菌主要寄生在植物的根部、茎干基部，尤其是边材。此病菌感染树木的形成层和外木质部，导 致典型的白色层状腐朽。多年生异担子菌的相关资料见附录A。 6仪器设备、试剂和培养基 6.1仪器设备 超净工作台、恒温培养箱、超低温冰箱、常规冰箱、高压灭菌锅、恒温水浴锅、小型离心机、显微 镜、PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像系统、制冰机、电子天平、涡旋振荡器、微量进样器等。 6.2试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。 10×ThermoPolBuffer，MgS04，dNTPs，甜菜碱，BstDNApolymerase，羟基萘酚蓝。 6.3培养基 马铃葡萄糖琼脂培养基（PDA）：将200g去皮马铃薯切成小块，沸水煮20min后过滤，弃去滤渣 在滤液中加入葡萄糖和琼脂粉各20g，加蒸留水定容至1L。配成溶液后121℃下灭菌20min。 7采样 样品的采集、分离、纯化和培养按照SN/T2589植物病原真菌检疫鉴定方法进行。样品采集后，放 入密封的容器内，送实验室。将取样结果进行记录，记录表格见附录B。样品应保存在-20℃下，避免 反复冻融。 8核酸制备和扩增反应 8.1核酸的制备 采用基因组提取试剂盒制备DNA，-20℃保存备用。将提取的多年生异担子菌的DNA用分光光度计测 定浓度，其质量浓度大于100pg·μL-1符合LAMP检测的要求。 8.2引物序列 正向外部引物F3：GTCCTGCACGACCAACTG， 反向外部引物B3：GGAATGACCTTGCCGACG， 正向内部引物FIP：TAGCAGTGGTGGCGTGGATGGTCATCCACGACAAGTACGG， 反向内部引物BIP：GGACCTTCCATGAAGGACTGGCCAGCACCAGTGGACGAAG， 正向环引物LF：CTCATCAAGCCCTCAACGATG， 反向环引物LB：GTGGCGGTCGTGGTGTT。 8.3扩增反应体系 检测多年生异担子菌的扩增反应体系为：2.5μL10×ThermoPolBuffer，8mmol·L-1MgS04，1.2 mmol·L-1dNTPs，内引物FIP和BIP各1.6μmol·L-1，外引物F3和B3各0.4μmol·L-1，环引物LF和LB各0.8DB3211/T1099—2024 3μmol·L-1，0.8μmol·L-1甜菜碱，8U·