ICS 11.220 B 41 备案号： 湖 DB42 北 省 地 方 标 准 DB42/T 734—2011 牛分枝杆菌 抗体胶体金试纸条检测方法 Colloidal Gold Strips to Detect the Antibody against Mycobacterium bovis 2011 - 08 - 18 发布 湖北省质量技术监督局 2011 - 09 - 18 实施 发 布 DB42/T 734—2011 目  次 前言..................................................................................................................................................................... II 引言................................................................................................................................................................... III 1 范围................................................................................................................................................................. 1 2 术语与定义..................................................................................................................................................... 1 3 缩略语............................................................................................................................................................. 1 4 原理................................................................................................................................................................. 1 5 牛结核病抗体胶体试纸条检测方法.............................................................................................................2 5.1 5.2 仪器与耗材............................................................................................................................................. 2 操作步骤................................................................................................................................................. 2 附录 A（规范性附录） 采样与样品处理注意事项....................................................................................... 3 附录 B（规范性附录） 牛分枝杆菌 MPB70/83 抗体检测胶体金试纸条的制备......................................... 4 I DB42/T 734—2011 前  言 本标准按 GB/T 1.1-2009《标准化工作导则 第 1 部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。 本文件的发布机构提请注意，声明符合文件时，可能涉及到附录B与胶体金试纸条制备相关的专利 的使用。 本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场。 该专利持有人已向本文件的发布机构保证，他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下， 就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以下联 系方式获得： 专利持有人姓名：华中农业大学。 地址：武汉市洪山区狮子山街1号。 请注意除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利 的责任。 本标准由华中农业大学提出。 本标准由湖北省农业厅归口。 本标准起草单位：华中农业大学。 本标准起草人：郭爱珍、陈颖钰、廖娟红、晁金、凌洁玉、陈焕春、杨利国、胡长敏。 II DB42/T 734—2011 引  言 牛结核病主要是由牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis）引起的一种人兽共患的慢性传染病，呈世界 性分布。世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须通报疫病与国际贸易必检对象，我国将其列为二类动 物疫病。临床上以肺结核、乳房结核和肠结核最为常见，健康牛可通过被污染的空气、饲料和饮水等经 呼吸道和消化道等途径感染。随着近年来我国奶牛业的蓬勃发展，我国牛结核病呈上升趋势。我省近年 来奶牛养殖数量不断增加，牛结核病防控形势严峻。 国际通用的牛结核病控制方法是“检疫－扑杀”，因此，准确检测牛结核病是净化与控制牛结核病 的前提。目前法定的检疫方法为牛结核菌素皮内变态反应，该方法操作费时繁琐，需要专业技术人员操 作，结果判断程序复杂且主观性强，在环境分枝杆菌感染时易出现假阳性反应，免疫抑制或结核病病程 后期动物对结核菌素的反应性降低。 牛分枝杆菌抗体胶体金检测试纸条是用牛分枝杆菌特异性蛋白检测牛分枝杆菌抗体的一种方法。该 方法简化了牛结核病检测的操作程序，可在栏圈旁检测，省时省力，简便快速。本标准的出台将为牛结 核病的快速诊断提供有力的技术依据，有助于我省乃至全国养牛业的健康发展。 III DB42/T 734—2011 牛分枝杆菌 抗体胶体金试纸条检测方法 1 范围 本标准规定了牛分枝杆菌抗体胶体金试纸条检测方法的原理和操作步骤。 本标准适用于牛结核病的诊断、检疫、监测与流行病学调查。 2 术语与定义 下列术语与定义适用于本标准。 2.1 胶体金 colloidal gold strip 金原子和胶体（如牛血清蛋白）通过静电引力、范氏力等结成的组合体。 2.2 多克隆抗体 polyclonal antibody 多种抗原表位刺激机体免疫系统后，机体产生的针对不同抗原表位的混合抗体。 3 缩略语 3.1 磷酸盐缓冲液 phosphate buffer solution 3.2 牛分枝杆菌特异性蛋白 70 MPB70 3.3 牛分枝杆菌特异性蛋白 83 MPB83 4 PBS 原理 牛感染牛分枝杆菌后，会产生针对该菌的特异性抗体，其中MPB70和MPB83是刺激抗体产生的重要细 菌蛋白，且具有抗原相似性。将胶体金标记MPB83，并加至金标垫上，将MPB70（检测带蛋白）和MPB83 多克隆抗体（质控带蛋白）分别包被在硝酸纤维素膜上，将金标垫、硝酸纤维素膜、样本垫、吸水垫和 PVC背撑等一起组装成检测板。待检牛血清加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前移动，与 金标垫上的胶体金标记MPB83相遇并结合，当进一步移动至固定的MPB70区域时，待检血清与金标MPB83 的结合物又与MPB70发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，肉眼即可观察到检测线上的胶体金显 色带。待检血清与金标MPB83的结合物进一步移动至固定的MPB83抗体区域时，又与MPB83抗体反应，肉 眼即可观察到质控线上的胶体金显色带。因此，牛结核病阳性时，胶体金试纸条出现检测带与质控带两 条带；而牛结核病阴性时，则只出现一条质控带。 1 DB42/T 734—2011 5 牛结核病抗体胶体试纸条检测方法 5.1 仪器与耗材 滴管、高压消毒锅、一次性注射器。 牛分枝杆菌MPB70/83抗体检测胶体金试纸条，应符合相关产品的质量标准（见附录B）。 5.2 操作步骤 5.2.1 样品处理 无菌采集待检牛血液2 mL，分离血清，立即检测或-20 ℃保存待检。 5.2.2 胶体金试验操作步骤 取待检血清样品100 μL～120 μL（滴管5滴～6滴），缓慢滴加到样品孔中，试纸条上将有红色条带 移动。若一分钟后仍然没有条带移动，向样品孔中再加入1滴待检血清样品。静置10 min，观察结果。 5.2.3 结果判定 结果判断如下图所示。 (1) 阳性结果（A）：在试纸条上出现两条红色条带（检测带和质控带）。 (2) 阴性结果（B）：在试纸条上仅出现一条红色条带（质控带）。 (3) 无效结果（C和D）：在质控带处不出现红色条带。 质控带 检测带 2 DB42/T 734—2011 AA 附 录 A （规范性附录） 采样与样品处理注意事项 本附录规定了采样与样品处理注意事项。 A.1 采血及血样处理过程，应进行无菌操作。存放血样的容器应洁净和无菌。 A.2 采样及实验过程中应注意个人防护，戴口罩、穿工作服和戴一次性手套。 A.3 待用的带滤芯吸嘴、吸嘴和离心管等应经过高压灭菌处理。 A.4 每次操作后应及时用 70%乙醇或 10%次氯酸钠溶液消毒处理检测区。操作区应有专门的废弃物容 器，废弃物应经高压消毒后方可按有关规定处置。 A.5 应符合《病原微生物实验室生物安全管理条例》的其它生物安全技术要求。 3 DB42/T 734—2011 BB 附 录 B （规范性附录） 牛分枝杆菌 MPB70/83 抗体检测胶体金试纸条的制备 附录B给出了牛分枝杆菌MPB70/83抗体检测胶体金试纸条的制备标准。 克隆表达和纯化MPB70和MPB83，制备和纯化兔抗MPB83蛋白多克隆抗体和MPB83-胶体金复合物。将 MPB83