ICS 65.020.30 B 44 DB15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 1901—2020 绵羊日粮可代谢生脂物质（MLS）指标的测 定技术规程 The technical specification for the determination of dietary metablizable lipogenous substances (MLS) in sheep 2020-06-10 发布 内蒙古自治区市场监督管理局 2020-07-10 实施 发 布 DB15/T 1901—2020 前 言 本标准按GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由内蒙古自治区农牧业科学院提出。 本标准由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC 19）归口。 本标准起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院。 本标准主要起草人：杜瑞平、卢德勋、高民、凌树礼、马燕芬、胡红莲、王丽芳、羿静。 I DB15/T 1901—2020 绵羊日粮可代谢生脂物质（MLS）指标的测定技术规程 1 范围 本标准规定了绵羊日粮可代谢生脂物质（MLS）指标的定义和测定方法。 本标准适用于绵羊日粮可代谢生脂物质（MLS）指标的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 30431 实验室气相色谱仪 HJ 957 水质 钴的测定 火焰原子吸收分光光度法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 挥发性脂肪酸 volatile fatty acids（VFA） 日粮中的碳水化合物经瘤胃微生物发酵后产生的重要产物，以乙酸、丙酸、丁酸为主，是反刍动物 的主要能量来源及合成乳脂肪和体脂肪的前体物。 3.2 可代谢生脂物质 metabolizable lipogenous substances（MLS） 饲料或日粮经动物消化吸收后，可以给动物本身提供的﹑可利用的生脂物质（折合成乙酸总量）， 单位为g/d。 3.3 瘤胃 VFA 基本产生速率 ruminal VFA production rate 瘤胃中每小时发酵生成的VFA毫摩尔数（mmol/h）。 3.4 瘤胃 VFA 流通速率 ruminal VFA flow rate 瘤胃中每小时向后消化道流通的VFA毫摩尔数（mmol/h）。 1 DB15/T 1901—2020 3.5 瘤胃 VFA 吸收速率 ruminal VFA absorption rate 每小时经瘤胃壁吸收的VFA毫摩尔数（mmol/h）。 3.6 瘤胃 VFA 吸收率 ruminal VFA fractional absorption rate 每小时经瘤胃壁吸收的VFA数量占每小时产生量的百分比（%）。 4 仪器和试剂 4.1 仪器 电子分析天平（0.0001 g），pH 酸度计，气相色谱仪，原子吸收仪，高速离心机（10000 rpm/min）。 4.2 试剂 乙酸、丙酸、丁酸、乙酸钴、乙二胺四乙酸、氢氧化钠、过氧化氢、乙醇等均为化学分析纯。 5 试验动物、日粮与饲养管理 5.1 试验动物 要求体况良好、年龄、体重相近的6只以上安装有永久性瘤胃瘘管的任一成年绵羊品种。 5.2 日粮配制 试验日粮可对应相应生理阶段参照中国或NRC绵羊饲养标准配制。 5.3 饲养管理 试验羊每隔3 h给予等量混和日粮，每日饲喂8次，每期试验在预饲期和灌注期内均单笼饲养，预饲 期10～14天，预饲期内试验羊自由饮水，灌注期停止供水，用灌注液满足水的需要。 6 测定步骤 6.1 标记物的制备、投放与乙酸、丁酸的灌注 6.1.1 标记物的制备 Co-EDTA的制备根据Uden等(1980)介绍的方法进行。称取25 g乙酸钴，29.2 g乙二胺四乙酸和4.0 g 氢氧化钠放入一个2 L烧杯中，加入200 mL蒸馏水，加热至80 ℃进行溶解，冷却后再加入20 mL 30 % 过氧化氢溶液，室温放置4 h后加入300 mL95 %(V/V)乙醇溶液，置于冰箱12 h，然后经定性滤纸过滤并 用85 %(V/V)乙醇溶液冲洗数遍。最后收集滤纸上粉红色物质于瓷盘中，置于100 ℃烘箱中烘干即可。 实测该Co－EDTA标记物Co 含量为14.08 %。 2 DB15/T 1901—2020 6.1.2 灌注前标记物的投放 连续饲喂10～14天后，灌注期第一天晨饲前采集20 mL瘤胃液后将1 g Co－EDTA溶于50 mL蒸馏水中 经采样管通过瘤胃瘘管灌入绵羊瘤胃内不同位点，灌注完毕再抽取瘤胃液反复冲洗采样管3次，并将冲 洗瘤胃液回灌瘤胃内。此后2 h、4 h、6 h、9 h、12 h、18 h和24 h分别抽取瘤胃液20 mL，用以测定 Co、pH和VFA。 6.1.3 乙酸﹑丁酸的启动灌注和连续灌注 6.1.3.1 启动灌注 上述Co-EDTA投放后继续连续饲喂一周，第八天晨饲前开始启动灌注，将100 mL启动灌注液通过注 射器经采样管迅速注入瘤胃内不同位点，灌注完毕用采样管充分搅匀瘤胃液，并抽取瘤胃液反复冲洗采 样管和注射器，冲洗瘤胃液及时回灌瘤胃内。 6.1.3.2 连续灌注 启动灌注结束后进行连续灌注。连续灌注3 h后开始从瘤胃取样，瘤胃液每2 h采一次，共采集5次。 连续灌注结束后，紧接着灌注水溶液，灌注速率不变，灌水中间每小时采瘤胃液一次，共采集3次，采 样结束后让羊自由采食、饮水。 6.1.4 乙酸、丁酸的启动灌注液和连续灌注液配制 启动灌注液和连续灌注液见附录A的表A.1、表A.2。 6.2 样品处理及分析方法 6.2.1 瘤胃液样品处理 采集的瘤胃液立即用四层纱布过滤，取4 mL瘤胃液,加1 mL25 %的偏磷酸固定，静置30 min，3000 rpm 下离心10 min，直接上机测定VFA和Co或-20 ℃冰箱保存待测。 6.2.2 VFA 测定 用气相色谱仪（GB/T 30431）依内标法进行测定，内标物为巴豆酸。 6.2.3 Co 的测定 原子吸收法测定应符合HJ 957的要求。 6.2.4 瘤胃液 pH 值 pH 酸度计直接测定。 7 计算公式 7.1 可代谢生脂物质（MLS）计算公式 可代谢生脂物质（MLS）按式（1）计算： 3 DB15/T 1901—2020 MLS=0.72*k1*Ac+1.8*k2*Bu +1.14*k3*Fat ..................... （1） 式中： MLS ——日粮可代谢生脂物质，单位为 g/d； 0.72 ——乙酸合成脂肪酸的效率； k1 ——瘤胃乙酸吸收率，单位为 %； Ac ——瘤胃乙酸基本产生量，单位为mmol/d，Ac等于瘤胃乙酸基本产生速率(mmol/h)乘24 h所得； 1.8 ——丁酸能值（2.194 MJ/mol）和乙酸能值（0.8763 MJ/mol）之比2.50再乘以0.72所得； k2 ——瘤胃丁酸吸收率，单位为 %； Bu ——瘤胃丁酸基本产生量，单位为mmol/d，Bu等于瘤胃丁酸基本产生速率(mmol/h)乘24 h所得； 1.14 ——脂肪酸能值（1.000 MJ/mol）和乙酸能值之比； k3 ——过瘤胃脂肪的小肠吸收率，单位为 %； Fat ——过瘤胃脂肪数量（以总脂肪酸数量表示)，单位为 mmol/d。 注：由于本标准验证试验采用的日粮为常规设计，不添加任何脂肪物质，因此所用日粮脂肪含量仅为2 %左右，过 瘤胃脂肪极少，因此公式中的第三部分在常规日粮条件下可忽略不计，所得数值为瘤胃乙酸部分和丁酸部分提 供。如果日粮添加了脂肪，则需测定过瘤胃脂肪量，需取小肠液先进行水解，将残余脂肪先水解为脂肪酸，然 后再测定总脂肪酸含量计算。 7.2 瘤胃乙酸、丁酸基本产生速率计算公式（以乙酸为例） 瘤胃乙酸基本产生速率按式（2）计算： P=I/(C’V’/CV-1) ............................... （2） 式中： P ——瘤胃乙酸基本产生速率，单位为mmol/h； I ——乙酸连续灌注恒定速率，60.00mmol/h； C’——灌注后瘤胃乙酸浓度，单位为mmol/L； V’——灌注后瘤胃液相体积，单位为L； C ——灌注前瘤胃乙酸浓度，单位为mmol/L； V ——灌注前瘤胃液相体积，单位为L。 7.3 连续灌注前后瘤胃液相体积计算公式 灌注前后的瘤胃液相体积按式（3）、（4）计算： V＝一次投放的Co量/ Co(0) ................................ （3） V'＝F’/K’ ................................... （4） 式中： V ——灌注前瘤胃液相体积，单位为 L； Co(0) ——投放时间点瘤胃液相Co浓度，单位为mg/L； V' ——灌注后瘤胃液相体积，单位为L； F’——灌注后瘤胃液相流通速率，单位为L/h； K’——灌注后瘤胃液相小时稀释速率，单位为/h。 7.4 灌注前后瘤胃液相小时稀释速率计算公式 灌注前后的瘤胃液相小时稀释速率按式（5）、（6）计算： -Kt Co(t)＝Co(0)*e .................................. （5） -K’t Co(t)＝Co(0)*e .................................. （6） 4 DB15/T 1901—2020 式中： Co(t) ——t 时间点瘤胃液相Co浓度，单位为mg/L； Co(0) ——投放时间点瘤胃液相Co浓度，单位为mg/L； K ——灌注前瘤胃液相小时稀释速率，单位为 /h； K'——灌注后瘤胃液相小时稀释速率，单位为 /h。 -Kt 注：一次性投Co-EDTA后，各时间点测得的瘤胃液相Co浓度的变化作指数方程模拟Co（t）=Co（0）*e ，可以得知 瘤胃液相小时稀释速率K及投放时间点的Co浓度。停止灌注乙酸、丁酸溶液改为灌注水后，试验羊瘤胃内Co浓 度的变化作指数方程模拟Co（t）=Co（0）*e ’ ,可得瘤胃液相小时稀释速率K'。 -K t 7.5 灌注前后瘤胃液相流通速率计算公式 灌注前后的瘤胃液相流通速率按式（7）、（8）计算： F＝V*K ....................................... （7） F'＝Co连续灌注速率/连续灌注后瘤胃液相Co浓度 ..................... （8） 式中： F ——灌注前瘤胃液相流通速率，单位为L/h； V ——灌注前瘤胃液相体积，单位为L； K ——灌注前瘤胃液相小时稀释速率，单位为