ICS 67.120.10 B 40 DB37 山 东 省 地 方 标 准 DB37/T 4048—2020 猪肉中阿托品残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 Determination of atropine residue in pork by high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry 2020 - 07 - 09 发布 山东省市场监督管理局 2020 - 08 - 09 实施 发 布 DB37/T 4048—2020 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所、五莲县畜牧兽医管理服务中 心。 本标准主要起草人：李霞、邓立刚、李增梅、徐宁、陈璐、马新凤。 I DB37/T 4048—2020 猪肉中阿托品残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 1 范围 本标准规定了猪肉中阿托品残留量的液相色谱-串联质谱测定方法。 本标准适用于鲜冻猪肉中阿托品残留量的测定。 本标准方法检出限为2 μg/kg，定量限为5 μg/kg。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 试样中的阿托品经磷酸二氢钾缓冲溶液提取，混合阳离子固相萃取柱净化（PCX净化柱），液相色 谱-串联质谱测定，外标法定量。 4 试剂或材料 除非另有说明，仅使用分析纯试剂，水符合GB/T 6682一级水的规定。 4.1 甲醇：色谱纯。 4.2 甲酸：色谱纯。 4.3 乙腈：色谱纯。 4.4 正己烷：色谱纯。 4.5 盐酸溶液（6 mol/L）：量取 50 mL 浓盐酸，用水稀释，转移至 100 mL 容量瓶中，用水定容至刻 度线，摇匀。 4.6 磷酸二氢钾缓冲溶液（0.1 mol/L）：称取磷酸二氢钾 13.6 g，加 900 mL 水溶解，用盐酸溶液（4.5） 调 pH 至 4.0，转移至 1 000 mL 容量瓶中并定容至刻度线，摇匀。 4.7 2 %氨化甲醇溶液：取 2 mL 氨水至 100 mL 容量瓶，用甲醇定容，摇匀。 4.8 阿托品（分子式 CAS：51-55-8）：纯度≥98 %。 4.9 阿托品标准储备液：准确称取阿托品标准品 0.01 g（准确至 0.000 01 g），用乙腈溶解并定容至 100 mL，摇匀，配制成质量浓度为 100 mg/L 标准储备液，避光-18 ℃保存，有效期 1 年。 4.10 阿托品标准中间液：准确移取 5 mL 阿托品标准储备液于 50 mL 容量瓶中，用乙腈定容，此时浓 度为 10 mg/L 的标准中间液，避光-18 ℃保存，有效期 6 个月。 4.11 固相萃取柱：混合阳离子交换固相萃取柱（PCX，150 mg/6 mL，或性能相当者）。 4.12 微孔滤膜：有机相，0.22 μm。 1 DB37/T 4048—2020 5 仪器设备 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 5.10 液相色谱—三重四级杆串联质谱仪：配电喷雾离子源（ESI 源）。 分析天平：感量 0.01 g 和 0.000 01 g。 高速匀浆机：转速不低于 10 000 r/min。 高速冷冻离心机：转速不低于 10 000 r/min。 pH 计。 涡旋振荡器。 氮吹仪。 固相萃取装置。 组织搅碎机。 超声清洗机。 6 样品 取适量新鲜或冷藏的猪肉样品，充分搅碎均匀，-18 ℃以下保存。 7 测定步骤 7.1 提取 称取平行试样5 g（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，加入磷酸二氢钾缓冲溶液（4.6）20 mL，加 盖后涡旋摇匀，超声处理15 min；4 ℃ 10 000 r/min离心5 min，转移上清液到50 mL离心管中。残渣 中再次加入20 mL缓冲溶液，重复提取一次，合并上清液，过滤，收集全部滤液于50 mL容量瓶中，用缓 冲溶液定容至50 mL，待净化。 7.2 净化 依次用6 mL甲醇、6 mL水和6 mL 0.1 %甲酸水溶液活化PCX固相萃取柱，准确移取5 mL提取液以小 于1 mL/min的流速过固相萃取柱，再依次用6 mL 0.1 %甲酸水溶液、6 mL甲醇、6 mL正己烷淋洗，弃去 淋洗液，抽干，最后用5 mL 2 %氨化甲醇（4.7）洗脱，收集洗脱液，40 ℃水浴氮吹至近干，准确加入 1 mL 0.1 %甲酸水溶液复溶，混匀，过滤膜，用于测定。 7.3 测定 7.3.1 仪器参考条件 液相色谱参考条件如下： a) 色谱柱：C18 色谱柱，柱长 100 mm，柱内径 2.1 mm，颗粒内径 1.7 μm，或性能相当者； b) 流动相：0.1 %甲酸水溶液（A 相），甲醇（B 相）； c) 流速：0.3 mL/min； d) 柱温：40 ℃； e) 进样体积：2.0 μL； f) 流动相梯度洗脱条件见表 1。 2 DB37/T 4048—2020 表1 流动相梯度洗脱程序 时间 流动相 A 流动相 B min % % 0.0 90 10 0.5 90 10 1.0 10 90 3.0 10 90 3.1 90 10 5.0 90 10 质谱参考条件如下： + a) 离子源：电喷雾离子源( ESI ）； b) 毛细管电压：3 KV； c) 离子源温度：130 ℃； d) 脱溶剂气温度：500 ℃； e) 扫描方式：正离子； f) 监测方式：多反应监测（MRM），监测条件见表 2。 表2 多反应监测（MRM）条件 化合物 阿托品 定性离子对 定量离子对 锥孔电压 碰撞能量 m/z m/z eV eV 10 22 10 30 290.2＞124.1 290.2＞93.1 290.2＞124.1 7.3.2 标准曲线的绘制 精确吸取一定量的标准中间溶液（4.10），逐级用乙腈稀释成质量浓度为1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、 10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL的标准工作溶液。空白基质溶液氮气吹至近干，加入1 mL 上述标准工作溶液复溶，过微孔滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定。以阿托品定量离子峰面积为纵坐 标，以阿托品基质标准溶液质量浓度为横坐标，绘制标准曲线。 7.3.3 定性及定量 7.3.3.1 定性测定 通过试样色谱图的特征离子与相应对照溶液各色谱峰的特征离子相对照定性。试样与标准品保留时 间的相对误差不大于2.5 %；试样特征离子的相对离子丰度与标准品特征离子的相对离子丰度一致，相 对离子丰度偏差不超过表3 的规定，则可判断试样中含有阿托品。 表3 定性确证时相对离子丰度的最大允许误差 相对离子丰度 ＞50 % ＞20 %～50 %（含） ＞10 %～20 %（含） ≤10 % 允许的相对偏差 ±20 ±25 ±30 ±50 7.3.3.2 定量 3 DB37/T 4048—2020 外标法定量。 7.4 试样溶液的测定 将基质标准工作溶液和试样溶液依次注入液相色谱—质谱联用仪中，保留时间和定性离子定性，测 定定量离子峰面积，待测样液中阿托品的响应值应在仪器检测的定量测定线性范围之内，超过线性范围 时应根据测定浓度进行适当倍数稀释后再进行分析。 7.5 空白试验 除不加试料外，按照7.1～7.4规定进行平行操作。 8 试验数据处理 试料中被测阿托品残留量以质量分数ω计，单位以微克每千克（μg/kg）表示，按公式（1）计算：    V 1 V 3 ................................... (1) m V 2 式中：  ——被试样中阿托品残留量，单位为微克每千克（μg/kg）；  ——从基质混合标准曲线上得到的样液中阿托品的质量浓度，单位为微克每升（μg/L）； V1 V2 V3 m ——试样提取液体积，单位为毫升（mL）； ——用于净化的上清液体积（mL）； ——氮吹后样品复溶体积（mL）； ——试样质量，单位为克（g）； 计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。 9 精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不大于这两个测定值的算数平均值的15 %。 4 DB37/T 4048—2020 AA 附 录 A （资料性附录） 阿托品特征离子质量色谱图 阿托品特征离子质量色谱图见图1。 图A.1 阿托品的特征离子质量色谱图（标准品浓度为 10 ng/mL） _________________________________ 5