ICS 13.060 C 51 DB37 山 东 省 地 方 标 准 DB37/T 4156—2020 水质 放线菌的测定 涂布平板法 Water quality—Determination of actinomycetes—Plate coating method 2020 - 09 - 25 发布 山东省市场监督管理局 2020 - 10 - 25 实施 发 布 DB37/T 4156—2020 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 方法原理 .......................................................................... 1 4 试剂和材料 ........................................................................ 1 5 仪器和设备 ........................................................................ 2 6 样品 .............................................................................. 2 7 分析步骤 .......................................................................... 3 8 结果计算与报告 .................................................................... 3 9 精密度 ............................................................................ 4 10 质量保证和质量控制 ............................................................... 4 11 废物处理 ......................................................................... 4 附录 A（资料性附录） 常见放线菌图片 .................................................. 5 I DB37/T 4156—2020 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由山东省住房和城乡建设厅提出并组织实施。 本标准由山东省城镇给水排水标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省城市供排水水质监测中心、潍坊市公用事业产品服务质量监测中心、国家 城市供水水质监测网福州监测站、国家城市供水水质监测网武汉监测站、泰安市自来水有限公司水质检 测中心、威海市水务水质检测中心有限公司。 本标准主要起草人：逯南南、贾瑞宝、孙韶华、赵清华、褚福敏、石近淼、田立平、朱光进、张颖、 孙婷婷、陶妍、王涛、逯凯、肖润泽、兰榕星、邢峰杰。 II DB37/T 4156—2020 水质 放线菌的测定 涂布平板法 1 范围 本标准规定了测定水中放线菌的涂布平板法。 本标准适用于生活饮用水及其水源水中放线菌的测定。 处理水样为1 L时，本方法的检测限为1 CFU/L。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 5750.2—2006 生活饮用水标准检验方法 水样的采集与保存 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 方法原理 放线菌是一类革兰氏染色阳性、具有菌丝、菌丝直径为0.5 μm～0.8 μm的原核细胞型微生物，属 于细菌范畴。用孔径为0.2 μm的聚碳酸酯膜过滤水样，对水中的放线菌进行浓缩富集，并用磷酸盐缓 冲液（PBS）洗脱截留在膜上的放线菌，将洗脱液涂布于选择性培养基上，经28 ℃±1 ℃培养7 d后，计 数平板上生长的典型放线菌菌落。 4 试剂和材料 4.1 重铬酸钾，纯度≥98 %。 4.2 硫代硫酸钠，纯度≥98 %。 4.3 硫代硫酸钠溶液：称取 0.5 g 硫代硫酸钠（4.2），精确至 0.1 g，溶于适量水中，定容至 100 mL， 121 ℃高压灭菌 20 min，备用。 4.4 革兰氏染色试剂盒（市售）。 4.5 无菌水：实验用水，水质满足 GB/T 6682 二级及以上分析实验室用水要求，经 121 ℃高压蒸汽灭 菌 20 min，备用。 4.6 高氏一号培养基：每 1 L 培养基中其成分及含量如下： 淀粉 20 g 琼脂 20 g 硫酸亚铁 0.01 g 硫酸镁 0.5 g 磷酸氢二钾 0.5 g 氯化钠 0.5 g 硝酸钾 1g 1 DB37/T 4156—2020 纯水 1 000 mL 将上述成分混合后，加热溶解，加入0.1 g重铬酸钾（4.1），混匀后分装，121 ℃高压灭菌20 min。 临用时加热融化琼脂，冷却至50 ℃～55 ℃，倾注平皿，冷凝备用。 也可以采用市售商品化培养基制品。 4.7 磷酸盐缓冲液： 氯化钠 8.01 g 氯化钾 0.2 g 磷酸氢二钠 1.44 g 磷酸二氢钾 0.24 g 上述成分溶解于950 mL的无菌水（4.5）中，用盐酸调节溶液pH值到7.4后加纯水定容至1 000 mL， 121 ℃高压灭菌20 min，备用。 4.8 聚碳酸酯滤膜：孔径 0.2 μm，直径 47 mm；121 ℃高压灭菌 20 min。 4.9 链霉菌标准菌株，有证标准菌株。 4.10 大肠埃希氏菌标准菌株，有证标准菌株。 5 仪器和设备 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 恒温培养箱：允许温度偏差 28 ℃±1 ℃。 高压蒸汽灭菌器：121 ℃可调。 真空抽滤装置。 显微镜：配备 10 倍目镜，10 倍、40 倍物镜。 电子天平：精确至 0.001 g。 移液枪：0 μL～200 μL。 漩涡振荡器。 镊子。 离心管：15 mL 和 1.5 mL。 6 样品 6.1 样品采集与保存 使用灭菌处理的玻璃瓶（也可选用有效期内市售无菌采样瓶和采样袋）采集水样，采样量不少于1 L。 加入硫代硫酸钠溶液（4.3）去除残留余氯（每125 mL容积加入20 μL硫代硫酸钠溶液，水源水放线菌测 定忽略此步），样品采集与保存按照GB/T 5750.2—2006中微生物指标要求执行。 6.2 样品富集 用无菌镊子（5.8）夹取滤膜（4.8）的边缘部分，贴放在灭菌的滤床上，稳妥的固定好真空抽滤装 置（5.3）。将1 L水样注入滤器中，打开真空泵抽滤。 注：针对富集困难的样品，抽滤过程中可以更换滤膜（2～3张），或者适当减少抽滤体积。 6.3 洗脱 抽滤完毕，取下滤膜放到已灭菌的15 mL离心管（5.9）中，加入5 mL磷酸盐缓冲液（4.7）后，漩涡 振荡器（5.7）上充分振荡5 min，使放线菌从膜上完全解离下来，得到浓缩液，待测。 2 DB37/T 4156—2020 7 分析步骤 7.1 梯度稀释 吸取100 μL浓缩液（6.3）加入到盛有900 μL磷酸盐缓冲液（4.7）的1.5 mL离心管（5.9）中，充 分混匀配制成1:10的稀释液；吸取1:10的稀释液100 μL加入到盛有900 μL磷酸盐缓冲液（4.7）的1.5 mL 离心管（5.9）中，充分混匀配制成1:100的稀释液；按同样方法稀释成1:1 000的稀释液备用。 7.2 涂布平板 分别取浓缩液原液、1:10的稀释液、1:100的稀释液、1:1 000的稀释液100 μL，用无菌涂布器均匀 涂布于高氏一号平板上，涂布时可转动培养皿，使菌液分布均匀。所有稀释度均需设置平行。 7.3 培养 将涂布好的平板放到隔水式恒温培养箱（5.1）中28 ℃±1 ℃倒置培养7 d。 7.4 染色与镜检 7.4.1 采用革兰氏染色试剂盒（4.4）对平板上生长的典型菌落进行革兰氏染色，并在显微镜（5.4） 下对革兰氏阳性菌株进行菌丝体确认。能否产生菌丝体及由菌丝体分化产生的各种形态特征是放线菌分 类鉴定的重要依据。 7.4.2 典型菌落通常具有以下特征，满足其一即可认定为典型菌落： a) 圆形、光滑或表面褶皱； b) 絮状、粉状或颗粒状； c) 菌落和培养基结合较紧密，菌落质地致密。 7.5 计数 根据染色结果对放线菌菌落进行计数。 8 结果计算与报告 8.1 稀释度的选择 8.1.1 选取放线菌菌落数在 30～300 之间的平板计算菌落数，若只有一个稀释度的平均菌落数符合此 范围，则将该稀释度计数值按照公式计算报出结果。 8.1.2 若有两个稀释度，其菌落数均在 30～300 之间，则视两者之比值来决定，若其比值小于 2，则 取两者的平均数按照公式计算报出结果；若大于或等于 2，则取其中稀释度较小的平均菌落数按照公式 计算报出结果。 8.1.3 若所有稀释度的菌落数均大于 300，则取稀释度最高的平均菌落数值按照公式计算报出结果。 8.1.4 若所有稀释度的菌落数均小于 30，则取稀释度最低的平均菌落数值按照公式计算报出结果。 8.1.5 若所有稀释度的平板上均无菌落生长，则以“未检出”报告。 8.2 结果计算 根据鉴定结果，按照公式（1）计算放线菌菌落数，以每1 L水样中的放线菌菌落数报告。 3 DB37/T 4156—2020 ........................... (1) 式中： M ——鉴定出的放线菌菌落数，CFU； N ——浓缩液的稀释倍数； V ——过滤水样体积，L； V1 ——浓缩液体积，mL； V2 ——涂板体积，mL。 8.3 结果报告 测定结果保留两位有效数字。当测定结果≥100 CFU/L时，以科学计数法表示；当测定结果低于检 测限时，则报“未检出”。 9 精密度