ICS 65.020.30 B 41 DB34 安 徽 省 地 方 标 准 DB 34/T 3653—2020 番鸭胚垂直传播病毒(RT-)PCR 检测 技术规范 Technical regulation for detection of vertical transmission viruses by (RT-)PCR from Muscovy Duck embryos 文稿版次选择 2020 - 06 - 22 发布 安徽省市场监督管理局 2020 - 07 - 22 实施 发 布 DB34/T 3653—2020 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由安庆永强农业科技股份有限公司提出。 本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：安庆永强农业科技股份有限公司、福建省农业科学院畜牧兽医研究所、利辛县绿 墅养殖专业合作社、安徽黄氏番鸭食品有限公司、阜阳市农业科学院。 本标准主要起草人：刘荣昌、刘友生、蒋晓璐、汪敏、赵巧珍、傅秋玲、黄瑜、黄永强、万春和、 郭大伟、傅光华、施少华、程龙飞。 I DB34/T 3653—2020 番鸭胚垂直传播病毒(RT-)PCR 检测技术规范 1 范围 本标准规定了番鸭胚垂直传播病毒（RT-）PCR检测技术的术语与定义、仪器与设备、试剂和材料、 操作步骤和结果判定。 本标准适用于番鸭胚垂直传播病毒的（RT-）PCR检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫 《禽流感防治技术规范》（农医发[2007]12号） 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 番鸭胚垂直传播病毒 Vertical transmission virus in Muscovy duck embryo 可以通过番鸭胚垂直传播的病毒统称，包括鸭甲肝病毒 1 型（Duck Hepatitis Virus type 1, DHAV-1）、鸭甲肝病毒 3 型（Duck Hepatitis Virus type 3, DHAV-3）、番鸭细小病毒（Muscovy Duck Parvovirus, MDPV）、鹅细小病毒（Goose Parvovirus, GPV）、番鸭呼肠孤病毒（Muscovy Duck Reovirus, MDRV）、新型番鸭呼肠孤病毒（Novel Muscovy Duck Reovirus, N-MDRV）、H9 亚型禽流感病毒（H9 subtype of Avian Influenza Virus, H9-AIV）。 4 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 仪器与设备 PCR 扩增仪。 台式低温高速离心机，温控范围：-4℃～25℃。 电泳仪，电压范围：60～120 V。 紫外凝胶成像系统。 组织匀浆器。 微波炉。 水浴锅，温控范围：37℃～100℃。 微量移液器，可调控量程：0.5～10 μL，10～100 μL，100～1000 μL。 1 DB34/T 3653—2020 5 试剂和材料 5.1 10％的十二烷基磺酸钠。 5.2 RNA 提取试剂 Trizol。 5.3 三氯甲烷。 5.4 焦炭酸二乙酯（DEPC）处理水，实验用水应符合 GB/T 6682 的要求。 5.5 磷酸盐缓冲液（PBS），见附录 A.1。 5.6 蛋白酶 K（10 mg/mL），见附录 A.2。 5.7 异丙醇。 5.8 Tris•饱和酚。 5.9 酚-三氯甲烷-异戊醇（25:24:1）。 5.10 75％乙醇，见附录 A.3。 5.11 乙酸钠（3 mol/L，pH 5.4）。 5.12 无水乙醇。 5.13 核糖核酸酶（20 mg/mL）。 5.14 TAE 电泳缓冲液，见附录 A.4。 5.15 10×加样缓冲液，见附录 A.5。 5.16 对照样品：DHAV-1、DHAV-3、MDPV、GPV、MDRV、N-MDRV 和 H9-AIV 阳性对照样品均为以上病毒 接种的番鸭胚尿囊液；阴性对照样品：未接种的正常番鸭胚尿囊液；以灭菌 PBS 为空白对照。 5.17 引物设计与合成：分别根据 DHAV 基因组 3’端核苷酸序列、GPV 和 MDPV 基因组 NS 基因、MDRV 的 δC 蛋白基因片段保守区设计特异性引物；H9 亚型 AIV HA 基因特异引物均参照农业部颁布的《禽流感 防治技术规范》（农医发[2007]12 号）进行合成，引物序列及预期片段大小说明见表 1： 表1 病毒名称 DHAV GPV 和 MDPV MDRV N-MDRV H9-AIV 6 引物 F:5’-AGGCCCAGAAGCATTCAAACA-3’ R:5’-TGGGTGTTTTACGTGTACTC-3’ 预期片段大小说明 DHAV-1为 258 bp，DHAV-3为 321 bp F:5’-CAATGGGCTTTTACCAATATGC-3’ R:5’-ATTTTTCCCTCCTCCCACCA-3’ F:5’-GAATCGTGGTCTAGCGAC-3’ R:5’-CTCGCATCTGCTGATCATAATTACC-3’ F:5’-ACCTCAGGATATCGCTGAAACT-3’ R:5’-CTCCATCCCTGCAGCACATGTAAAG-3’ F:5’-TCAACAAACTCCACCGAAACTGT-3’ R:5’-TCCCGTAAGAACATGTCCATACCA-3’ 操作步骤 6.1 操作方法 以下所有实验室操作均按照 GB 19489 和 GB/T 27401 中给出的方法执行。 6.2 2 样品采集与处理 641 bp 580 bp 600 bp 732 bp DB34/T 3653—2020 6.2.1 采集对象 选择孵化过程中的死亡种番鸭胚、晚啄壳种番鸭胚和孵出的 1 日龄弱雏作为采集对象。 6.2.2 样品采集 6.2.2.1 6.2.2.2 6.2.2.3 6.2.2.4 6.2.3 对未形成胚体或胚体较小的种番鸭胚，无菌采其尿囊液。 对孵化期间死亡的种番鸭胚，无菌采集其胚体。 对无尿囊液的大日龄种番鸭胚、晚啄壳种番鸭胚等，则无菌采集胚体的肝脏和脾脏组织。 对刚出壳的 1 日龄弱雏，按每批次不少于 10 羽的要求随机无菌采集其肝脏和脾脏组织。 样品的处理 采集的尿囊液经 8000 g 离心 10 min，取上清分装后，于 -20℃冻存备用；采集的组织经剪碎处 理后，与 PBS 按照体积比 1:3 的比例制成组织匀浆液，反复冻融 3 次，8000 g 离心 10 min，取上 清分装后，于 -20℃冻存备用。 6.3 6.3.1 PCR 检测 核酸 DNA 提取方法 6.3.1.1 取 420 μL 组织匀浆液和 30 μL 核糖核酸酶加入 1.5 mL 灭菌离心管混匀后，室温作用 20 min。 6.3.1.2 取 40 μL 10％的十二烷基硫酸钠溶液和 10 μL 蛋白酶 K 溶液，56℃水浴 2 h。 6.3.1.3 加入等量的 Tris·饱和酚，颠倒充分混匀，12000 g 离心 5 min ，小心吸取上层水相于另一 1.5 mL 灭菌离心管中。 6.3.1.4 加入等量的酚-三氯甲烷-异戊醇（25:24:1），颠倒充分混匀，12000 g 离心 5 min ，小心吸 取上层水相于另一 1.5 mL 灭菌离心管中。 6.3.1.5 加入 1/10 体积的乙酸钠、2 倍体积冰冻预冷的无水乙醇混匀后，-20℃放置 2 h。12000 g 离 心 15 min，弃去乙醇。加入 600 μL 75％冰冻预冷的乙醇清洗 2 次，倒置于吸水纸上 5 min，室温晾干。 加入 20 μL 灭菌双蒸水溶解沉淀，-20℃放置备用。 6.3.2 核酸 DNA 样品 PCR 扩增方法 6.3.2.1 PCR 反应体系为 50 μL，每个反应管的反应液配置为：依次加入 5 μL 10×PCR 缓冲液，上下 游引物（引物浓度均为 20 μM）各 1 μL，4 μL dNTP Mixture（各 2.5 mM），1 μL 提取的核酸 DNA， 37.5 μL 灭菌双蒸水，0.5 μL Taq 聚合酶。2000 g 离心 15 s，使反应混合液都沉降到 PCR 管底。 6.3.2.2 将上述反应混合液按照以下步骤进行 PCR 扩增，94℃预变性 5 min； 循环参数为 94℃变性 50 s，54℃退火 30 s，72℃延伸 35 s，循环 35 次；第三步 72℃再延伸 7 min 结束。 6.3.3 核酸 DNA 样品 RFLP 分析（EcoRⅠ酶切）方法 对其中的 MDPV 和 GPV 阳性样品，分别取 20 μL PCR 产物，3 μL 10×H 缓冲液，5 μL 灭菌双蒸 水，2 μL EcoRⅠ酶，37℃水浴 1 h。 6.4 6.4.1 RT-PCR 检测 核酸 RNA 提取方法 6.4.1.1 取 250 μL 组织匀浆液加入 1.5 mL 灭菌离心管后，加入 750 mL RNA 提取试剂 Trizol，充分 混匀 15 s，再加入 200 μL 预冷的三氯甲烷，充分倒置混匀，室温静置 10 min。 3 DB34/T 3653—2020 6.4.1.2 4℃条件下，12000 g 离心 15 min。取经焦炭酸二乙酯（DEPC）处理水处理的 1.5 mL 灭菌离 心管，小心吸取离心上清液 600 μL，加入等体积预冷的异丙醇，颠倒混匀。 6.4.1.3 4℃条件下，12000 g 离心 15 min。轻轻倾倒上清液，加入 800 μL 75%乙醇清洗 2 次，倒置 于吸水纸上 5 min，室温晾干。 6.4.1.4 加 20 μL 焦炭酸二乙酯（DEPC）处理水，轻轻混匀溶解离心管壁上核酸 RNA，2000 g 离心 30 min，提取的 RNA 应在 2 h 内进行 RT-PCR 扩增或保存于 -80℃。 6.4.2 核酸 RNA 样品 RT-PCR 扩增方法 6.4.2.1 PCR 反应体系为 50 μL，每个反应管的反应液配置为：依次加入 28 μL 焦炭酸二乙酯（DEPC） 处理水，5 μL 反转录酶缓冲液，5 μL Taq 聚合酶缓冲液，1 μL dNTP，1 μL Taq 聚合酶，1 μL 反转 录酶，1 μL