ICS 65.120 B 46 DB34 安 徽 省 地 方 标 准 DB 34/T 818—2020 代替 DB34/T 818-2008 饲料中盐酸克伦特罗的测定 层析法 胶体金免疫 Determination of clenbuterrol hydrochloride in feeds Colloidal gold immunochromatographic method 文稿版次选择 2020 – 09 - 03 实施 2020 - 08 - 03 发布 安徽省市场监督管理局 发 布 DB34/T 818—2020 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准代替 DB34/T 818-2008《饲料中盐酸克伦特罗的测定—胶体金免疫层析法》，除编辑性修改 外主要技术变化如下： ——修改了标准名称，删除了标准名称中的连接符“-”； ——修改了范围，明确适用于配合饲料、浓缩饲料和预混合饲料中盐酸克伦特罗的快速检测（见第 1 章）； ——修改了试剂和材料内容（见第 4 章）； ——增加了仪器设备（见第 5 章）； ——增加了饲料采样要求（见第 6 章）和试样制备要求（见 7.1）； ——修改“实验步骤”为“检测步骤”，并修改了部分内容，优化了样品提取（见第 7 章）； ——修改了结果判断内容，“方法确认”改为“有效性确认”（见第 8 章）； ——修改结果确认方法表述（见第 9 章）； ——增加了附录 A 检测结果判断示意图（见附录 A）。 本标准由安徽省兽药饲料监察所提出。 本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：安徽省兽药饲料监察所、合肥华盟生物技术有限公司、安徽省公众检验研究院有 限公司、安徽华澳生物技术有限公司、宿州市兽药饲料管理站、太湖县小池镇农业农村综合服务中心、 铜陵市动物疫病预防与控制中心、铜陵市义安区畜牧兽医局、安徽省水产技术推广总站、宁国市农业产 业化发展服务中心。 本标准主要起草人：许世富、李生龙、赵德祥、何学丰、陈文帮、范萍萍、张玉、何为俊、孙德祥、 童成亮、刘舜舜、张云凯。 I DB34/T 818—2020 饲料中盐酸克伦特罗的测定 胶体金免疫层析法 1 范围 本标准规定了饲料中盐酸克伦特罗快速检测的胶体金免疫层析法。 本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和预混合饲料中盐酸克伦特罗的快速检测。 本标准检测限为 10 µg/kg。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 14699.1 饲料采样 GB/T 20195 动物饲料 试样的制备 3 原理 本方法采用胶体金竞争抑制法。将氯金酸用枸橼酸钠还原法制成一定直径的金溶胶颗粒，标记抗体。 硝酸纤维素膜为载体，利用了微孔膜的毛细管作用，将样本滴加在胶体金检测条样品垫一端，使液体慢 慢向吸水纸另一端渗移。在样本移动的过程中，会发生相应的抗原抗体反应，并通过免疫金的颜色而显 示出来。样本中的克伦特罗在流动的过程中与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制了抗体和硝酸纤维素 （NC）膜检测线上的克伦特罗人工抗原的结合，使检测线不显颜色，结果为阳性；反之，检测线显紫红 色，结果为阴性。 4 试剂和材料 4.1 除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为符合 GB/T 6682 规定的二级水。 4.2 胶体金免疫层析快速检测卡组成 4.2.1 盐酸克伦特罗特异性抗体。 4.2.2 胶体金。胶体金溶液采用氯金酸还原法制备，应为带负电的紫红色疏水胶体金溶液，金颗粒大 小应在 30 nm～60 nm 之间。 4.2.3 硝酸纤维素膜。硝酸纤维素膜表面应平整、光滑、白净，没有划痕、凹印、小孔、水迹、橘皮 状或其他肉眼能见的瑕疵，无灰尘、油渍或其他杂物。硝酸纤维素膜宽度为 25.4±0.5 mm，长度在 100±2 mm，厚度在 185±19 μm，毛细流速度为 180±45 s/40 mm。 4.2.4 聚酯纤维膜。聚酯纤维膜表面形状应为基本均匀的矩形，无明显歪斜现象。色泽好，白色，表 面洁净，均匀度好，无破损，无起皱，无污点，无色斑，无霉点，无异味，无杂质及灰尘。聚酯纤维膜 2 重量在 98.3±10.0 g/m ，厚度在 0.42±0.07 mm，长度为 305.0±2.5 mm，宽度为 254.0±2.5 mm。 4.2.5 吸水纸。 1 DB34/T 818—2020 4.2.6 底板。 4.2.7 塑料盒。 4.2.8 塑料吸管。 4.2.9 提取液。 4.3 阴性对照：取不含盐酸克伦特罗的空白样品，作为空白试料。 4.4 阳性对照：取盐酸克伦特罗标准工作液用水稀释为 10 µg/L。 4.5 盐酸克伦特罗标准品。 4.6 0.1 mol/L 盐酸溶液：取 9 mL，加水稀释到 1 000 mL，摇匀。 4.7 0.1 mol/L 氢氧化钠溶液：取澄清的氢氧化钠饱和溶液 5.6 mL，加水稀释到 1 000 mL，摇匀。 5 仪器设备 5.1 5.2 5.3 6 电子天平：感量分别为 0.01 mg 和 1 mg。 离心机：≥3 000 rpm。 酸度计。 采样 按 GB/T 14699.1 或相关标准规定的方法采样。 7 检测步骤 7.1 试样制备 按 GB/T 20195 的规定制备试样。 7.2 样品提取 取饲料约 0.5 g，装入 10 mL 离心管，加提取液 1.5 mL，浸泡 5 min～10 min，期间振荡 2 次～ 3 次；静置 30 min 或者 3000 rpm 离心 5 min～10 min；若样品不为中性，则用 0.1 mol/L 盐酸溶 液（4.6）或 0.1 mol/L 氢氧化钠溶液（4.7）调节 pH 至 7.0±0.1；取上清液备用。 7.3 溶液制备 7.3.1 盐酸克伦特罗储备液 准确称取盐酸克伦特罗标准品适量，用甲醇溶解后稀释成 1 mg/mL 的储备液，－18℃冰箱中贮存 备用，有效期 3 个月。 7.3.2 盐酸克伦特罗标准工作液 取盐酸克伦特罗储备液，用水稀释至 100 μg/L，4℃中贮存备用，有效期 1 个月。 7.4 样品检测 7.4.1 从包装袋中取出盐酸克伦特罗胶体金免疫层析快速检测卡，置于平整的台面上，检测卡应即开 即用。 2 DB34/T 818—2020 7.4.2 用塑料吸管（4.2.8）垂直滴加 2 滴（约 60 μL～80 μL）无气泡上清液（7.2）于加样孔（S） 内，每批需做阴性对照和阳性对照各一个，加样方法同待测样品。 7.4.3 加样后 5 min 时观察结果。 8 8.1 结果判断 有效性确认 8.1.1 阴性对照在检测区（T）出现显色条带（参见附录 A，下同），所有阳性对照在检测区（T）均 不出现显色条带，且质控区（C）出现一条显色条带，说明检测卡有效，可进行检测。 8.1.2 如阴性对照检测区（T）不出现显色条带，或阳性对照检测区（T）出现显色条带，或质控区（C） 不出现一条显色条带，说明检测卡无效，不能进行检测。 8.2 测定结果 8.2.1 阳性（+）：仅质控区（C）出现一条显色条带，在检测区（T）内无显色条带出现。阳性结果表 明：样本中含有盐酸克伦特罗且含量在检测限以上。 8.2.2 阴性（-）：两条显色条带出现。一条位于检测区（T）内，另一条位于质控区（C）内。阴性结 果表明：样本中不含盐酸克伦特罗或其含量在检测限以下。 8.2.3 无效：质控区（C）未出现显色条带，表明本次检测无效（失效原因包括操作过程不当或检测卡 已过有效期等）。在此情况下，应再次仔细阅读说明书，更换检测卡重新检测。 9 结果确认 阳性样品应使用色谱质谱联用法进行确认。 3 DB34/T 818—2020 AA 附 录 A （资料性附录） 检测结果判断示意图 阴性（-） 阳性（+） 图A.1 无效 检测结果判断示意图 _________________________________ 4