(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210973826.0 (22)申请日 2022.08.15 (71)申请人 中国人民解 放军空军 军医大学 地址 710032 陕西省西安市新城区长乐西 路169号 (72)发明人 邹远康　骆文静　张建彬　耶一晨　 张克英　官瑞丽　董倩　 (74)专利代理 机构 成都九鼎天元知识产权代理 有限公司 51214 专利代理师 胡东东 (51)Int.Cl. C12N 5/0797(2010.01) C12N 5/00(2006.01) C12M 1/22(2006.01) C12M 3/00(2006.01)C12M 1/00(2006.01) (54)发明名称 一种原代神经干细胞体外三维培养系统及 其培养方法 (57)摘要 本发明公开了一种原代神经干细胞体外三 维培养系统及其培养方法， 包括细胞培养皿， 所 述细胞培养皿内部的底部设置有凹槽， 卫星培养 小室板由多个卫星培养小室组合形成， 卫星培养 小室的底部向外凸出形成圆弧形结构， 以构成三 维培养室， 三维培养室放置于所述凹槽内， 多个 卫星培养小室呈阵列排布， 同排的卫星培养小室 之间可拆卸链接， 同列的卫星培养小室之间固定 连接， 所述卫星培养小室用于培养原代神经干细 胞， 所述细胞培养皿用于构成细胞培养的密闭环 境。 本发明的原代神经干细胞体外三维培养系统 结合培养方法， 除了可以进行三维仿真培养以 外， 还能够使细胞贴附更为牢靠， 培养出原代细 胞符合原代神经干细胞的特性， 且 具有非常好的 增殖能力。 权利要求书2页 说明书6页 附图3页 CN 115287261 A 2022.11.04 CN 115287261 A 1.一种原代神经干细胞体外三维培养系统， 包括细胞培养皿， 其特征在于， 包括细胞培 养皿， 所述细胞培养皿内部的底部 设置有凹槽， 所述凹槽与卫星培养小室板的底部配合， 所 述卫星培养小室板由多个卫星培养小室组合形成， 所述卫星培养小室的底部向外凸出形成 圆弧形结构， 以构成三 维培养室， 所述三 维培养室放置于所述凹槽内， 所述多个卫星培养小 室呈阵列排布， 同排的卫星培养小室之 间可拆卸链接， 同列的卫星培养小室之间固定连接， 所述卫星培养小室用于培养原代神经干细胞， 所述细胞培养皿用于构成细胞培养的密闭环 境。 2.如权利要求1所述的原代神经干细胞体外三维培养系统， 其特征在于， 同排的卫星培 养小室之间通过铰合扣实现可拆卸链接 。 3.如权利要求2所述的原代神经干细胞体外三维培养系统， 其特征在于， 同列的卫星培 养小室之间通过固定支 架实现固定连接 。 4.一种原代神经干细胞体外三维培养方法， 其特征在于， 采用上述权利要求1 ‑3任一所 述的培养系统进行原 代神经干细胞体外三维培 养， 培养方法包括以下步骤： S1、 获得特定脑组织， 将脑组织剪碎并倒入试管中， 然后加入Accutase酶消化， 反复用 塑料吸管吹打 混合， 并重复多次； S2、 将步骤S1的试管置于离心机中进行离心处理， 弃去上清液， 加入原代神经干细胞增 殖培养液， 取新试管， 用过滤器将含原代神经干细胞的生长培养液过滤至新试管中， 经细胞 计数板计数后， 用原代神经干细胞增殖培养液调整细胞密度为5 ×105cells/mL， 然后接种 于细胞培 养瓶中进行培 养， 12h以后细胞培 养瓶中有悬浮的神经球形成， 得到神经球； S3、 用多聚鸟氨酸包被卫星培养小室， 恒温包被12h后， 用灭菌的双蒸水吸取多余的多 聚鸟氨酸， 然后用层 粘连蛋白包被卫星培养小室， 恒温包被4h后， 向卫星培养小室中加入一 定浓度的PBS， 备用； S4、 取步骤S2得到的神经球， 离心去上清液， 用PBS清洗沉淀， 然后用Accutase酶消化， 反复用塑料吸管吹打混合， 重复此操作后， 以5 ×103cells/mL的细胞密度在包被有多聚鸟 氨酸和层 粘连蛋白的卫星小室板上铺板， 培养12h后， 加入适量的生长培养液或原代神经干 细胞分化培 养液， 每隔2d更 换一次。 5.如权利要求4所述的原代神经干细胞体外三维培养方法， 其特征在于， 所述原代神经 干细胞增殖培养液的配方为： 96mL  DF12细胞培养基， 96mL  Neurobasal培养基， 4mL  B27， 2mL N2、 200 μL bFGF， 200 μL bEGF， 2mL青 霉素‑链霉素双抗。 6.如权利要求5所述的原代神经干细胞体外三维培养方法， 其特征在于， 在步骤S3中， 多聚鸟氨酸的浓度为15 μg/mL， 层粘连蛋白的浓度为20 μg/mL。 7.如权利要求4所述的原代神经干细胞体外三维培养方法， 其特征在于， 所述原代神经 干细胞分化培 养液的配方为： 低糖DM EM培养基， 2％B27， 1％FBS。 8.如权利要求4所述的原代神经干细胞体外三维培养方法， 其特征在于， 在步骤S3中， PBS的加入量 为0.01M。 9.如权利要求4所述的原代神经干细胞体外三维培养方法， 其特征在于， 所述获得特定 脑组织的方法包括以下步骤： A、 启动超净台， 向培 养皿中加入DF12试剂， 然后置 于冰盆中冷却， 待用； B、 处死孕鼠， 取出子宫浸泡入培养皿中， 从组织中分离出胎鼠， 将胎鼠头身用眼科剪分权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115287261 A 2离， 用尖头镊子取出胎鼠脑组织， 在体式显微镜下剥离脑组织上的血管膜与血管， 即得到特 定脑组织。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115287261 A 3