ICS 11.020 CCS C 05 DB22 吉林省地方标准 DB 22/T 3567 —2023 肿瘤基因突变检测——高通量测序技术规 范 Technical regulation of next-generation gene sequencing for tumor gene mutation detection 2023 - 09 - 28 发布 2023 - 11-16 实施 吉林省市场监督管理厅 发布 DB22/T 3567 —2023 I 前 言 本文件按照GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由吉林省卫生健康委员会提出并归口。 本文件起草单位：吉林大学。 本文件主要起草人：姜艳芳、胡欣彤、何佳雪、陈立国、王多、李昂、张鹏、刘勇。 DB22/T 3567 —2023 1 肿瘤基因突变检测 ——高通量测序技术规范 1 范围 本文件规定了肿瘤基因突变检测-高通量测序检测技术的生物安全要求、材料与试剂、样本、测序 流程、质量控制和废弃物处理。 本文件适用于肿瘤基因突变检测的高通量测序检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 GB/T 30989 高通量基因测序技术规程 SN/T 1193 基因检验实验室技术要求 YY/T 1723 高通量基因测序仪 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 生物安全要求 4.1 采样及检测过程所涉及的实验操作应按 GB 19489、GB/T 309 89、SN/T 1193 规定执行。 4.2 为保证生物安全，检测应在指定的区域内进行。区域分区可分为：试剂准备区、样本制备区、打 断区、文库制备区、扩增一区、杂交捕获区、扩增二区、测序区等，见图 1。 图1 5 材料与试剂 5.1 仪器与耗材 DB22/T 3567 —2023 2 5.1.1 微量移液器：10 µL、100 µL、200 µL、1000 µL 。 5.1.2 微量带滤芯吸头：10 µL、100 µL、200 µL、1000 µL。 5.1.3 实时荧光定量 PCR 仪。 5.1.4 离心管：200 µL、1.5 mL、2 mL、10 mL、15 mL。 5.1.5 高通量测序仪：高通量测序仪质量应符合 YY/T 1723 的要求。 5.1.6 生物分析仪。 5.1.7 微量核酸定量仪：可检测低至 10 pg/ μL的DNA。 5.1.8 微量分光光度计和荧光分光光度计。 5.1.9 基因扩增仪。 5.2 试剂 5.2.1 试剂级别：除另有规定，本方法试验用水应符合 GB/T 6682 规定的二级水，所用化学试剂均为 分析纯。 5.2.2 核酸提取试剂。 5.2.3 荧光 PCR 试剂。 5.2.4 RNase A。 5.2.5 测序反应通用试剂盒。 6 样本 6.1 采集、保存及质量要求 6.1.1 手术组织样本：在显微镜下确认肿瘤细胞所占比例应≥30%，坏死细胞所占比例应≤10 %，相关 的病理检测结果保存备查。新鲜组织样本在含福尔马林或 DNA/RNA 保存液保存，常温下可保存 1 个月。冻存样本需在样本采集后立即放入液氮完全冷冻，-80 ℃低温保存，干冰运输。 6.1.2 石蜡组织/切片组织：10%中性福尔马林固定手术标本，按病理学操作规范进行取材。石蜡包埋 病理组织或切片样品应确定含有肿瘤病变细胞，FFPE 样本的组织面积应介于 0.5 cm 2～1 cm2，切片用 量为 5 片～10 片，厚度为 5 μm～10 μm，用载玻片片盒或者离心管保存，常温保存、运输。活检材料的固定时间一般是 24 h以内。 6.1.3 外周血：采集外周血提取血浆游离 DNA 进行检测，使用血浆游离 DNA 专用采血管采集外周血 10 mL，在常温条件下，ctDNA 在全血中可稳定保存 7 d。 6.1.4 体液：体液中的肿瘤细胞用于基因检测时，需确认肿瘤细胞，穿刺获得胸腹水样本提交给细胞 病理检查之后，剩余液体冷藏/冷冻保存，或在含有细胞成分的离心沉淀中加入含有蛋白质变性剂的缓冲液室温保存。体液中的 ctDNA 用于基因检测时，使用血浆游离 DNA专用采血管采集新鲜体液 10 mL。 6.2 样本提取 6.2.1 手术组织样本/离心后的体液中肿瘤细胞 应采用常规的DNA/RNA提取试剂盒。 6.2.2 石蜡组织/切片组织 宜使用能提取石蜡包埋组织微量DNA/RNA的试剂盒。 6.2.3 外周血/体液 DB22/T 3567 —2023 3 检测样本中的ctDNA宜使用ctDNA提取试剂盒。 6.3 质量评价 使用微量核酸定量仪、微量分光光度计和荧光分光光度计、生物分析仪或凝胶电泳将样本的核酸提 取物进行质量评价。 7 测序流程 7.1 文库构建 7.1.1 文库制备方法主要有杂交捕获和扩增子建库，应对检测基因、区域或突变热点进行描述，并建 立实验室检测 SOP，按照 SOP 执行。 7.1.2 单样本文库分子通常需要经历文库编码、扩增、定量和混合等步骤后进行上机测序。上机前需 要对测序文库进行定量和片段大小分析，保证文库质量能满足上机要求。 7.1.3 根据检测项目设定文库质量的要求，并明确接受或拒绝的标准。 7.2 高通量测序 7.2.1 NGS 测序仪主要有检测氢离子释放和荧光信号两大技术平台。 7.2.2 测序时根据检测样本量和质量要求确定适当的芯片，以保证测序质量和靶区覆盖深度。 7.2.3 录入芯片编号、测序方案，如读长、单端/双端测序、barcode 信息等内容，按测序仪操作流程 进行测序。 7.3 生物信息学分析 7.3.1 NGS 数据生物信息学分析可分为以下两个主要步骤： a) 对测序数据进行质控分析及过滤。 b) 对通过质控的序列与参考序列进行比对，对变异位点进行鉴定分析并注释。 7.3.2 生物信息学流程中所用各种生物信息分析软件，应通过适量标准品测序数据进行验证，证明所 用软件及参数可达到临床报告要求。 7.3.3 数据分析的软件应根据指南更新版本。 7.4 检测报告 7.4.1 报告内容 报告内容应包括以下内容 c) 患者姓名、年龄、住院号/门诊号、送检单位/科室、送检医师、现病史等基本信息。 d) 样本编号、样本种类、采样日期、送检日期、接收日期。 e) 检测项目、检测方法、检测范围、检测结果。 f) 检测者、审核者及报告时间。 7.4.2 对检出的基因变异的解释 对检出的基因变异解释应包括如下内容： a) 基因变异检测结果。 b) 用药提示。