ICS65.020.30 CCS B 41 DB65 新疆维吾尔自治区地方标准 DB 65/T 4666—2023 牛羊布鲁氏菌天然半抗原琼脂扩散试验 鉴别诊断方法 A differential identification method of native hapten agar gel immuno-diffusion test for brucellosis of bovine and sheep 地方标准信息服务平台 2023-07-20发布 2023-09-20实施 新疆维吾尔自治区市场监督管理局 发布 地方标准信息服务平台 DB 65/T 4666—2023 前言 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由新疆生产建设兵团畜牧兽医工作总站提出。 本文件由新疆维吾尔自治区畜牧兽医局归口并组织实施， 本文件起草单位：新疆生产建设兵团畜牧兽医工作总站、新疆畜牧科学院兽医研究所（新疆畜牧科 学院动物临床医学研究中心）、中国动物卫生与流行病学中心、青岛瑞尔唯特生物技术有限公司。 本文件主要起草人：李岩、刘丽娅、易新萍、田莉莉、曹瑞、马晓菁、金庭辉、屈勇刚、叶锋、 文亮、钟发刚、施远翔、张家瑞、张力、焉鑫、殷涛、宋洁、张旭、张子荣、连晓春、何立雄。 本文件实施应用中的疑问，请咨询新疆生产建设兵团畜牧兽医工作总站。 对本文件的修改意见建议，请反馈至新疆维吾尔自治区畜牧兽医局（乌鲁木齐市天山区新华南路408 号）、新疆生产建设兵团畜牧兽医工作总站（乌鲁木齐市米东区米东南路2188号红光雅居7号公建楼）、 新疆畜牧科学院兽医研究所（新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心）（乌鲁木齐市新市区冬融街726 号）、中国动物卫生与流行病学中心（青岛市市北区南京路369号）、新疆维吾尔自治区市场监督管理 局（乌鲁木齐市新华南路167号）。 新疆维吾尔自治区畜牧兽医局联系电话：0991-8568089；传真：0991-8527722；邮编：830004 新疆生产建设兵团畜牧兽医工作总站联系电话：0991-4641759传真：0991-4641759；邮编：830021 新疆畜牧科学院兽医研究所（新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心）联系电话：0991-3098109； 传真：0991-3098109；邮编：830013 新疆维吾尔自治区市场监督管理局联系电话：0991-2818750传真：0991-2311250；邮编：830004 地方标准信息服务平台 地方标准信息服务平台 DB 65/T 4666—2023 牛羊布鲁氏菌天然半抗原琼脂扩散试验鉴别诊断方法 1 范围 本文件规定了牛羊布鲁氏菌天然半抗原琼脂扩散试验方法的术语和定义、生物安全要求、仪器、设 备和试剂、检测步骤及结果判定的要求。 本文件适用于新疆维吾尔自治区范围内布鲁氏菌A19-△VirB12株、A19株和M5株疫苗免疫区牛羊 布鲁氏菌病血清学检测。天然半抗原琼脂扩散试验适用于牛羊免疫2个月后，可鉴别区分布鲁氏菌疫苗 A19-△VirB12株、A19株和M5株免疫抗体与感染抗体。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T18646动物布鲁氏菌病诊断技术 GB19489实验室生物安全通用要求 NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3. 1 布鲁氏菌天然半抗原琼脂扩散试验 native hapten agar gel immuno-diffusion test （NH-AGID） 布鲁氏菌外膜光滑型脂多糖（S-Lipopolysaccharide，S-LPS）和天然半抗原（NativeHapten，NH） 是布鲁氏菌抗原中重要的两种检测标识物。S-LPS是布鲁氏菌的一种优势抗原，疫苗免疫接种或感染布 鲁氏菌均会刺激动物机体产生S-LPS抗体。而NH抗原在布鲁氏菌活动期或排菌期可持续刺激动物机体 产生NH抗体，NH抗体的产生与布鲁氏菌活动性感染密切相关。应用NH-AGID试验中NH沉淀线，可鉴 别区分布鲁氏菌疫苗免疫动物与感染动物，并判定布鲁氏菌在感染动物体内的活动（排菌）状态。 准信息服务平台 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 NH：天然半抗原（NativeHapten） S-LPS：光滑型布鲁氏菌脂多糖（SmoothLipopolysaccharide） NH-AGID：天然半抗原琼脂扩散试验（NativehaptenAgarGel Immuno-Diffusiontest） RBT：虎红平板凝集试验（RoseBengalTest） iELISA：间接酶联免疫吸附试验（indirectEnzyme-LinkedImmunoSorbentAssay） Ag：抗原（Antigen） BSL：生物安全等级（BiologicalSafetyLevel） DB65/T4666—2023 5生物安全要求 5.1样品的采集和血清分离运输应按照NY/T541的规定执行。 5.2实验操作及实验废弃物无害化处理应按照GB19489的规定执行。 6仪器、设备和试剂 6.1仪器和设备 恒温恒湿培养箱（温度：10℃～60℃）、普通冰箱（-20℃～4℃）、可调微量移液器（10μL～ 100μL)。 6.2试剂 6.2.1商品化的布鲁氏菌病虎红平板凝集试验抗原。 6.2.2商品化的布鲁氏菌病间接酶联免疫吸附试验检测试剂盒。 6.2.3商品化的布鲁氏菌天然半抗原琼脂扩散试验检测试剂盒（包含琼脂平板、S-LPS和NH混合抗 原、阳性对照血清和阴性对照血清）。 7试验检测步骤 7.1 样品采集及处理 应按照NY/T541的规定，采集经布鲁氏菌A19-△VirB12株疫苗或A19株疫苗按照标准剂量皮下注射 接种3月龄～6月龄的牛免疫2个月后全血，标记编号；采集经布鲁氏菌M5株疫苗按照标准剂量皮下注 射3月龄～5月龄羔羊免疫2个月后全血，标记编号，分离血清后4℃保存备用，长期保存应放置于-18℃ 以下。 7.2布鲁氏菌血清学阳性样本初步筛选 应按照GB/T18646一2018中4.4、4.8的条款要求进行虎红平板凝集试验（RBT）或间接酶联免疫吸 附试验（iELISA）检测及结果判定。对RBT或iELISA检测结果为阳性的血清样品，应用天然半抗原琼 脂扩散试验方法（NH-AGID）进行检测。 7.3天然半抗原琼脂扩散试验操作方法 7.3.1试验前，将检测试剂和待检血清样品置于室温（23土2）℃充分回温。 7.3.2按照图1中所示的7孔梅花孔示意图进行加样，中间孔为抗原加样孔标记为Ag，按照顺时针标 记周边孔的编号，分别标记为1～6，琼脂平板制备见附录B。 7.3.3在琼脂平板的中心抗原孔（Ag）中加入15μLS-LPS和NH混合抗原，混合抗原制备见附录A 支务平台 7.3.4在琼脂平板“1”号孔中加入15μL布鲁氏菌病阳性对照血清。 7.3.5在琼脂平板“4”号孔中加入15μL布鲁氏菌病阴性对照血清。 7.3.6在琼脂平板其余4个加样孔（2，3，5，6）中分别加入15μL被检血清，并记录样品编号。 7.3.7 将琼脂平板平整置于湿盒内，放入（25土3）℃的恒温培养箱内孵育24h～48h。 2 DB 65/T 4666—2023 抗原 阳性对照 待检样品 待检样品 阴性对照 图1 加样示意图 8试验结果判定 8.1判定方法 在孵育24h～48h后取出琼脂平板，使用斜射光源读取结果。采用黑色纸做底板，从不同折光角度 观察平皿中心抗原孔与待检血清孔之间有无沉淀线及所在位置和数量。 8.2试验成立条件 当阳性对照血清孔与中心抗原孔（Ag）之间出现S-LPS沉淀线和NH沉淀线见图2中1号孔，而阴性 对照血清孔与中心抗原孔（Ag）之间未出现沉淀线见图2中4号孔，试验成立；否则，应重新进行试验。 8.3结果判定 当被检血清孔与中心抗原孔（Ag）之间出现S-LPS和NH两条沉淀线见图2中3号孔，判定该被检血 清为布鲁氏菌感染抗体阳性，且该动物机体内的布鲁氏菌处于活动期或排菌期。 当被检血清孔与中心抗原孔（Ag）之间仅出现一条S-LPS沉淀线见图2中5号孔，判定该被检血清为 布鲁氏菌疫苗（A19-△VirB12株、A19株或M5株）免疫抗体阳性。 当被检血清孔与中心抗原孔（Ag）之间未出现沉淀线见图2中2号孔和6号孔，判定该被检血清为布 鲁氏菌抗体阴性。 标准信息服务平台 图2检测结果示意图