ICS65.020.01 CCS B 16 DB65 新疆维吾尔自治区地方标准 DB 65/T 4645—2023 苹果枝枯病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Erwinia amylovora(Burrill 1882) Hauben etal.1999 地方标准信息服务平台 2023 - 07 -20 发布 2023-09-20实施 新疆维吾尔自治区市场监督管理局 发布 DB65/T4645—2023 前 言 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由乌鲁木齐海关提出。 本文件由乌鲁木齐海关归口并组织实施。 本文件起草单位：乌鲁木齐海关技术中心，石河子大学，成都市标准化研究院，上海海关动植物与 食品检验检疫技术中心。 本文件主要起草人：王，蒋刚强，陈好娟，巴哈提古丽·马那提拜，龙志新，孙燕飞，张小菊， 徐金玉，史茜，刘俊，易建平，谢伟，王均祥，范伟功，王斌，刘秀玲，张飞宇，兰菲，周岩，黄萍。 本文件实施应用中的疑问，请咨询乌鲁木齐海关技术中心。 对本文件的修改意见建议，请反馈至乌鲁木齐海关技术中心（乌鲁木齐市南湖北路116号）、乌鲁 木齐海关（乌鲁木齐市北京南路295号）、新疆维吾尔自治区市场监督管理局（乌鲁木齐市新华南路167 号）。 乌鲁木齐海关技术中心联系电话：0991-4182756；邮编：830063 乌鲁木齐海关联系电话：0991-3267855；邮编：830011。 新疆维吾尔自治区市场监督管理局联系电话：0991-2817197；传真：0991-2311250；邮编：830004 地方标准信息服务平台 DB 65/T 4645—2023 苹果枝枯病菌检疫鉴定方法 1范围 本文件规定了苹果枝枯病菌检疫鉴定方法的苹果枝枯病菌基本信息、方法原理和检测流程、仪器设 备和主要试剂、检疫鉴定方法、结果判定、样品及资料保存的要求。 本文件适用于蔷薇科植物及其产品在生产、运输过程中对苹果枝枯病菌的检疫鉴定。 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 3术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4苹果枝枯病菌基本信息 4.1苹果枝枯病菌名称 中文名：苹果枝枯病菌 学名：Erwinia amylovora(Burrill，1882)Hauben et al.1999 英文名：FireBlight 4.2分类地位：细菌域（Bacteria），变形菌门（Proteobacteria），-变形菌纲 （Gammaproteobacteria），肠杆菌目（Enterobacteriales），肠杆菌科（Enterobacteriaceae）， 欧文氏菌属（Erwinia）。 4.3传播途径：染病的繁殖材料（包括种苗、砧木和接穗）、昆虫、鸟、风、雨、灌溉水、修剪工 具、废弃有症状枝条以及被污染的包装材料和运输工具等许多自然因素和人为因素都可引起苹果枝 枯病的传播。其中，染病的繁殖材料、鸟类是苹果枝枯病远距离传播的主要途径。 准信息服务平 4.4苹果枝枯病菌的其他信息参见附录A。 5方法原理和检测流程 5.1方法原理 根据苹果枝枯病菌田间危害症状、寄主范围、培养性状、生物学特性及特异性DNA序列，对病原菌 进行分子生物学检测、分离培养鉴定、致病性测定（首次检出阳性需做，后期可选做）；快检方法根据 苹果枝枯病菌单克隆抗体与抗原特异性结合进行酶联免疫吸附检测（仅供田间疑似样品的检疫）。 5.2检测流程 DB 65/T4645-2023 典型/可疑植物组职 剪降设泡或研陷组织 胶体金免疫试纸条快险 分子生物学检测 （仅仪傲目同疑似样品的检疫） 分离培养 凝似菌菜 分子生伤学检测 （实验室百决检出阳性需数款病性） 阳性 未价出苹果技枯病菌 检出苹果枝枯病菌 未检出张果核括病菌 6仪器设备和主要试剂 6.11 仪器设备及用具 超净工作台、恒温培养箱、摇床、超低温冰箱、常规冰箱、高压灭菌锅、恒温水浴锅、小型离心机、 高速冷冻离心机、显微镜、PCR仪、实时荧光PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像系统、制冰机、 电子天平、涡旋振荡器、微量进样器、烘箱等。 6.2主要试剂 双务平台 金免疫试纸条快速检测所需试剂应符合附录D的要求。 6.3培养基 6.3.1MM,C,培养基配制方法：L-天门冬酰胺4.0 g，K,HPO.2g，MgSO,·7H,00.2g，NaC13g，烟酸 0.2g，盐酸硫胺（VB,）0.2g，山梨醇10g，CuS0·5H,02mM，琼脂15.0g，加蒸馏水至1000mL， 湿热灭菌（121℃，15min）。烟酸和盐酸硫胺过滤灭菌，高压灭菌后加入。 2 DB 65/T 4645—2023 6.3.2Ze1ler改良高糖培养基配置方法：牛肉浸膏8g，蔗糖50g，放线菌酮50mg，0.5%溴百里酚 兰 9ml，0.5%中性红 2.5ml，琼脂20g，水 1000 mL，pH7.4。 6.3.3营养琼脂培养基（NA）培养基配置方法：胰蛋白陈10g，牛肉粉3g，氯化钠5g，琼脂15g， 加双蒸水至1000mL，调节pH至7.3±0.1，湿热灭菌（121℃，15min）。 7检疫鉴定方法 7.1症状检查 参照附录A中的症状描述检查植株有无苹果枝枯病的典型症状，早春花期及幼果期重点调查监测。 主要检查嫩梢、花、果和枝干等部位，观察嫩梢是否出现萎（拐杖状）、变黑枯死；花和幼果是否变 黑枯死；叶脉是否从叶柄基部向上变黑；枝干是否有溃疡斑；以及病组织上是否有菌脓。对出现典型症 状或可疑症状的植株进行拍照记录，并采集表现症状的嫩梢、花簇、枝干、幼果等送实验室检测鉴定。 对于无症的幼嫩枝条，应重点对其顶端和基部取样。 7.2样品采集和制备 7.2.1显症植株样品采集和制备 7.2. 1. 1疑似样本采集后宜尽快检测，若不能及时检测，样本须在 4°C～8°C 下保存，不应超过一周。 采集样品以及在运输和处理过程中应注意避免交叉污染。 7.2.1.2样品处理应采用对分离培养和分子生物学检测都有效的通用程序。样品用无菌蒸馏水或pH 7.4的 PBS（NaC1 8 g；KC1 0.2 g；Na,HPO,· 12H,0 2.9 g；KH,PO, 0.2 g；蒸馏水 1 L）处理，直接用 于分离培养和分子生物学检测。 7.2.1.3宜尽可能选择表现出最典型症状并带有菌脓的植物部位（花朵、嫩梢、幼枝、叶片或果实）。 处理用的材料挑取病健交界部位，将植物组织切成大约0.1 g1.0g的小块，放入装有适量PBS或无 菌蒸馏水的离心管或培养血中研磨或挤压，静置≥5min，制成样品悬浮液，用于后续分离培养和分子 生物学检测。 7.3胶体金免疫试纸条快检 对于疑似症状样品，如新鲜的叶片、幼果等，可利用商品化免疫胶体金试纸条进行现场快速检测， 具体步骤应按照附录B的要求。若检测结果为阴性，直接判定为未检出苹果枝枯病菌。若检测结果为阳 你准信息 性，需进行分离培养鉴定及致病性测定。亦可不进行胶体金免疫试纸条检测，直接进行分子生物学检测。 7.4分子生物学检测 根据实验室条件，检测方法应符合7.4.2或7.4.3中的相关规定。 7.4.1模板制备 7.4.1.1对于植株样品，按照步骤7.2的方法制备成样品悬浮液后，直接用商业化植物基因组DNA提 取试剂盒按照操作说明提取样品总DNA，-20℃保存备用。 7.4.1.2对于分离培养得到的疑似菌株，可直接或经裂解处理后（97℃沸水浴10min；12000r/min 离心10min，取上清，-20℃保存）作为分子生物学检测反应模板。 7.4.2PCR凝胶电泳检测 DB 65/T 4645-2023 以E.amylovora标准菌株作阳性对照，用非E.amylovora的植物细菌作阴性对照，以双蒸水代替模 板作为空白对照，对待测样品进行PCR凝胶电泳检测，具体检测步骤应按照附录C的要求。 7.4.3实时荧光PCR检测 实时荧光PCR检测具体步骤应按照附录D的要求，对照及植物内对照设置同7.4.2。 7.5分离培养鉴定 7.5.1按照步骤7.2的方法制备成样品悬浮液后，用灭菌接种环蘸取悬浮液在选择性培养基MM.Cu、 Zeller和NA培养基平板上划线分离，或者用无菌水对样品悬浮液进行10倍梯度稀释，各取100μL 稀释液涂板分离，各重复3次。28℃恒温培养24h～48h，挑取可疑单菌落进行纯化，转接2次～3 次，随后进行菌落和菌株形态观察，致病性测定或分子生物学鉴定。 7.5.2在MM.C,培养基上，苹果枝枯病菌菌落圆形、边缘规则、黄色、较大而凸起，有粘液，光滑呈透 镜状。 7.5.3在Zeller培养基上，苹果枝枯病菌菌落橙红色半球形，高度隆起，中心色深，有蛋黄状中心环， 表面光滑，边缘整齐，菌落大小为3mm～7mm。 7.5.4在NA培养基上，苹果枝枯病菌菌落圆形、边缘规则、无色、较大而凸起，有粘液，光滑呈透 镜状。 7.6致病性测定（实验室首次检出需做致病性） 根据实验室条件，检测方法应符合7.6.1或7.6.2中的相关规定。 7.6.1幼果接种试验 取梨幼果（直径3cm~5cm）洗净晾干，用75%的酒精擦拭幼果表面，做表面灭菌处理后，用灭菌 刀片横切果实，置垫有灭菌滤纸的培养血上（加少量无菌水）。用接种针蘸取在MM,C,或NA培养基上培养 24h～48h的待鉴定菌落，针刺接种到幼果的果肉组织，一个横切面接种3个或4个点。接种后，28℃ 保湿培养，诱导发病和菌脓的形成。大约24h后，观察接种部位有无坏死和菌脓产生。实验以无菌水为 对照。 7.