ICS67.080.01 CCSB31 6528 巴音郭楞蒙古自治州地方标准 DB6528/T191—2023 大蒜品种纯度SSR分子标记鉴定法 PurityidentificationofgarlicvarietybySSRmolecularmarkers 2023-08-01发布 2023-08-15实施 巴音郭楞蒙古自治州市场监督管理局  发布 DB6528/T191—2023 I目次 前言..................................................................................II 1范围................................................................................1 2规范性引用文件......................................................................1 3术语和定义..........................................................................1 4原理................................................................................1 5仪器设备和试剂......................................................................1 5.1仪器设备........................................................................2 5.2试剂............................................................................2 6方法步骤............................................................................2 6.1取样............................................................................2 6.2DNA提取.........................................................................2 6.3分子标记筛选....................................................................2 6.4PCR扩展反应体系.................................................................3 6.5PCR扩展反应程序.................................................................3 6.6非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳........................................................4 7纯度计算............................................................................4 附录A（规范性）溶液配制..............................................................5 A.1溶液配制........................................................................5 附录B（规范性）制胶及电泳过程........................................................6 B.1制胶及电泳过程..................................................................6 参考文献...............................................................................7 DB6528/T191—2023 II前言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由新疆巴音郭楞蒙古自治州农业农村局提出、归口并组织实施。 本文件起草单位：新疆巴音郭楞蒙古自治州农业科学研究院。 本文件主要起草人：李辉玲、杨晓莉、李守明、张建文、雷芙蓉、李保山、姚青青、王国洪、张国 儒、赵靓、程裕伟、杨寒丽。 本文件实施中的疑问，请咨询新疆巴音郭楞蒙古自治州农业科学研究院。 对本文件的修改意见或建议，请反馈至新疆巴音郭楞蒙古自治州农业农村局（库尔勒市石化大道64 号）、新疆巴音郭楞蒙古自治州农业科学研究院（新疆库尔勒市英下路巴州农科院）、自治区农科院园 艺所（新疆乌鲁木齐市沙依巴克区新疆南昌路403号）、新疆巴音郭楞蒙古自治州市场监督管理局（新 疆库尔勒市延安路巴州市场监督管理局）。 新疆巴音郭楞蒙古自治州农业农村局联系电话:0996-2036172；邮编：841000 新疆巴郭楞蒙古自治州农业科学研究院联系电话：0996-2695780；邮编：841000 新疆巴音郭楞蒙古自治州市场监督管理局联系电话:0996-2266036；邮编：841000 DB6528/T191—2023 1大蒜品种纯度SSR分子标记鉴定法 1范围 本文件规定了大蒜品种纯度SSR分子标记鉴定的原理、仪器设备和PCR反应相关试剂、方法步骤和纯 度计算的要求。 本文件适用于焉耆盆地巴音郭楞蒙古自治州大蒜品种纯度鉴定。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3术语和定义 3.1 3.2聚合酶链式反应polymerasechainreaction 利用单链寡核苷酸引物对特异DNA片段进行体外快速扩增的一种方法。 3.3 3.4SSR标记simplesequencerepeats 由几个核苷酸（1个～6个）为重复单位聚集而成的长达几十个至几百个bp（一般为100bp～200bp） 的串联重复序列，又称微卫星序列或短串联重复序列，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。 3.5 3.6分子标记molecularmarker 以蛋白质、核酸分子的多态性为基础，鉴定生物在遗传上的差异。 3.7 3.8品种纯度varietypurity 品种在SSR分子标记带型方面典型一致的程度，用具有本品种特异带型的送检样品数占总检测样品 数的百分率表示，以反映某品种特征特性的一致性程度。 4原理 SSR分布于大蒜整个基因组，每个位点上重复单位的数目不同造成了品种间的多态性，利用PCR技术 将多态的SSR扩增出来，通过6.0％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物，利用电泳图谱进行大蒜 品种纯度鉴定。 5仪器设备和试剂 DB6528/T191—2023 25.1仪器设备 PCR仪：垂直电泳槽；水平电泳槽；高压电泳仪（3000V，400mA，400W）；核酸浓度测定仪；万 分之一电子天平；组织研磨仪；微量加样器；台式高速离心机；紫外可见成像系统；医用胶片观察灯； 水平摇床；高压灭菌锅；微波炉；冰箱；数码相机。 5.2试剂 乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）；三羟甲基氨基甲烷（Tris）；盐酸（HCl，36％）；氯化钠（NaCl）； 氢氧化钠（NaOH）；硼酸；溴酚蓝；甲叉双丙烯酰胺；丙烯酰胺；无水乙醇；四甲基乙二胺（TEMED）； 过硫酸铵；冰醋酸；硝酸银；甲醛溶液（37％）；TaqDNA聚合酶（含Mg2+的10×PCR缓冲液）；四种脱 氧核糖核苷酸（dNTPs）；SSR引物；琼脂糖；GoldView染料；DNA提取试剂盒；实验用水为双蒸水或 符合GB/T6682规定的一级水。除特殊说明外，所用试剂均为分析纯试剂。 相关溶液配制方法见附录A。 6方法步骤 6.1取样 检测样品为大蒜鳞茎，应符合GB/T3543.2的规定，质量应无腐烂、病斑，样品数量应不少于30头、 60瓣，样品质量应不少于500g。 6.2DNA提取 在玻璃培养皿底部垫上一层厚度3mm的棉花或滤纸，用水浸湿后均匀地摆放检测样品鳞茎，置于光 照培养箱中。培养条件为光照强度3000Lx条件下16h、35℃光照培养；无补光条件下8h、28℃暗 培养。相对湿度70％。待鳞茎长出鳞叶后备用。称取鳞叶200mg左右用植物基因组DNA提取试剂盒内步 骤提取DNA，所提取DNA浓度和纯度用核酸浓度检测仪测定，DNA完整性用DNA凝胶电泳检测。DNA溶液的 OD260/OD280值应在1.7～2.0之间，或质量能符合检测要求。最终于—20℃冰箱中保存。 注：以上为推荐的DNA提取方法。其他能够达到PCR扩增质量要求的DNA提取方法也适用于本文件。 6.3分子标记筛选 宜选择编号1号～8号引物为对品种纯度测定引物，