style="width:3.62008in;height:0.6666in" /> (1) 本文是学习GB-T 15400-2018 饲料中色氨酸的测定. 而整理的学习笔记,分享出来希望更多人受益,如果存在侵权请及时联系我们
本标准规定了饲料中色氨酸含量测定的高效液相色谱法和分光光度法。
本标准适用于饲料原料、配合饲料、浓缩饲料和精料补充料中色氨酸的测定。
高效液相色谱法的定量限为0.02%;当试样最大称样量为700 mg,
水解液稀释倍数为25倍时，分
光光度法的定量限为0.04%。
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GB/T 6433 饲料中粗脂肪的测定
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 14699.1 饲料 采样
GB/T 20195 动物饲料试样的制备
试样中的色氨酸经氢氧化锂溶液水解，用高效液相色谱法分离，紫外或荧光检测器检测，外标法
定量。
除特殊注明外，本标准所用试剂均为分析纯。
3.2.1 水：符合GB/T 6682 中一级水的规定。
3.2.3 氢氧化钾溶液(0.1 mol/L): 称取0.56 g 氢氧化钾，溶解于100 mL
水中，即得。
3.2.4 氢氧化锂溶液(4 mol/L): 称取83.9 g 氢氧化锂，溶解于500 mL
水中，即得。
3.2.5 乙酸钠缓冲溶液(0.0085 mol/L Na+,pH=4.5):称取0.70 g
无水乙酸钠，溶解于1000 mL 水
中，用冰乙酸调节 pH 为4.5。
3.2.6 流动相：乙酸钠缓冲溶液(3.2.5)+甲醇(3.2.2)= 95+5。
3.2.7 L-色氨酸标准储备溶液：准确称取25 mg (精确到0.0001 g)
色氨酸对照品(纯度大于99%),置 于25 mL
烧杯中，用滴管滴加氢氧化钾溶液(3.2.3)使其溶解，将其定量地转移至250 mL
棕色容量瓶 中，用水定容，浓度为100μg/mL。2℃~8℃ 保存，有效期为1个月。
3.2.8 L-色氨酸标准系列溶液：准确移取 L-色氨酸标准储备溶液(3.2.7)5.00
mL、7.50 mL、 10.00 mL、12.50 mL、15.00 mL、17.50mL分别置于25 mL
棕色容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀。其 溶液浓度分别为20μg/mL、30
μg/mL、40 μg/mL、50μg/mL、60μg/mL和70μg/mL。2℃~8℃ 保 存，有效期为2周。
GB/T 15400—2018
3.3.1 天平：感量0.0001 g、感量0.001 g。
3.3.2 聚四氟乙烯水解管：配衬管和密封垫。
3.3.3 恒温干燥箱：可达到110℃±2℃。
3.3.4 离心机：转速不低于4000 r/min。
3.3.5 高效液相色谱仪：配紫外检测器或者荧光检测器。
按 GB/T14699. 1 的规定，抽取有代表性的饲料样品，用四分法缩减取样。按
GB/T 20195 制备试 样，磨碎，全部通过0.25 mm
孔筛，混匀，装入密闭容器中，备用。取适量试样，按照GB/T 6433 测定试
样脂肪含量。
平行做两份试验。称取未脱脂试样50 mg ～ 100 mg(精确至0 .0001 g),
置于聚四氟乙烯水解管 (3.3.2)衬管中，加1.5 mL 氢氧化锂溶液(3.2.4),充氮1
min, 旋紧密封盖后放入110℃± 2℃恒温干 燥箱(3.3.3)中，水解20 h
。取出水解管，冷却至室温，用乙酸钠缓冲溶液(3.2.5)将水解液定量地转移至
25mL 容量瓶中，并用上述缓冲溶液定容，离心或者过0.45μm
滤膜后上液相色谱仪测定。
称取脱脂后的试样，按照3.5.1步骤进行水解。
色谱柱：Cis, 长250 mm, 内径4.6 mm, 粒 度 5 μm, 或性能相当者。
流动相：见3.2.6。
流速：1.0 mL/min。
柱温：室温。
进样体积：10μL～ 20μL。
检测器：紫外或二极管矩阵检测器，检测波长280 nm。
荧光检测器，激发波长：283 nm; 发射波长：343 nm。
按上述规定的色谱条件平衡色谱柱，向色谱柱注入相应的色氨酸标准系列溶液(3.2.8)和试样溶液
(3.5.1或3.5.2),以保留时间定性；在线性范围内，用外标法单点校正定量。色氨酸标准溶液色谱图参
见附录 A 中图 A.1。
3.6.1 未脱脂试样中的色氨酸含量以质量分数w;
计，数值以克每100克表示，按式(1)计算：
style="width:3.62008in;height:0.6666in" /> (1)
GB/T 15400—2018
式中：
A; —— 试样溶液峰面积值；
V — 试样稀释体积，单位为毫升(mL);
p —— 色氨酸对照品溶液的质量浓度，单位为微克每毫升(μg/mL);
Vs— 色氨酸对照品溶液进样体积，单位为微升(μL);
A 。—— 色氨酸对照品溶液峰面积平均值；
m —— 试样质量，单位为克(g);
V: — 试样溶液进样体积，单位为微升(μL)。
3.6.2 脱脂试样中的色氨酸含量以质量分数w。
计，数值以克每100克表示，按式(2)计算：
style="width:4.96009in;height:0.65318in" /> (2)
式中：
F— 脂肪含量，%。
式中其他参数同式(1)解释。
测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留两位小数。
在重复性条件下，当试样中色氨酸含量小于0.
1%时，两次独立测定结果的绝对差值应不大于
0.01%。当试样中色氨酸含量在0.1%～0.5%时，两次独立测定结果与其平均值的绝对差值，应不大于
该平均值的3%。当试样中色氨酸含量大于0.5%时，两次独立测定结果与其平均值的绝对差值，应不
大于该平均值的2%。
饲料中蛋白质经碱水解后，降解成多肽和游离的氨基酸。在硫酸介质中、氧化剂亚硝酸钠存在下，
色氨酸与对二甲氨基苯甲醛缩合反应生成蓝色化合物，其吸光度在一定范围内与色氨酸含量成正比。
除特殊注明外，本标准所用试剂均为分析纯。
4.2.1 水：符合 GB/T 6682 中二级水的规定。
4.2.2 氢氧化钾溶液(10%):称取100 g 氢氧化钾，溶解于1000 mL 水中，即得。
4.2.3 硫酸溶液(21.2 mol/L): 量取589 mL 硫酸，缓慢加入约350 mL
水中，冷却后用水稀释至1L。
4.2.4 对二甲氨基苯甲醛溶液：称取1.0 g
对二甲氨基苯甲醛溶于硫酸(4.2.3)中并定容至100 mL, 临 用现配。
4.2.5 亚硝酸钠溶液(0.2%):称取0. 1 g 亚硝酸钠，溶解于50 mL
水中，临用时制备。
4.2.6 L- 色氨酸标准储备溶液：同3.2.7。
4.2.7 L- 色氨酸标准系列溶液：同3.2.8。
GB/T 15400—2018
4.3.4 分光光度计，配1 cm 比色皿。
同3 .4。
4.5.1.1 脂肪含量小于4%的试样
平行做两份试验。参考附录 B 中 表 B.1 的称样量，称取试样0. 16 g～0.7
g(精确至0 . 0001 g) 于
50mL 容量瓶中，在轻轻振摇中缓慢加入25 mL
氢氧化钾溶液(4.2.2),使试样湿润且不粘壁，置于培
养箱(4.3.2)中水解16 h～18h 。
取出水解液冷却至室温，用水定容至刻度，摇匀。取部分水解液以
4000 r/min 转速离心15 min, 备用。
4.5.1.2 脂肪含量大于4%的试样
称取脱脂后的试样，按照4.5. 1. 1步骤进行水解。
4.5.2.1 L- 色氨酸标准系列溶液的显色
精密移取水和L- 色氨酸标准系列溶液(4.2.7)各浓度溶液1 mL, 分别置于10 mL
具塞试管中，水为 试剂空白。向每支试管内加入氢氧化钾溶液(4.2.2)1 mL,
混匀。将试管放入冷水盆中，加5 mL 对 二 甲氨基苯甲醛溶液(4 .2
.4),从冷水盆中取出试管摇匀，在20℃~30℃放置30 min。 向每支试管内加
入0.2 mL 亚硝酸钠溶液(4.2.5),摇匀，放置25 min。
4.5.2.2 试样溶液的显色
取 2 mL 试样溶液(4.5.1.1或4.5.1.2)置于10mL
具塞试管中，并将试管放入冷水盆中，加5 mL 对
二甲氨基苯甲醛溶液(4.2.4),从冷水盆中取出试管，摇匀。再从每个试样溶液中另取2
mL 置于10 mL 具塞试管中，加5 mL
硫酸溶液(4.2.3)作为样品空白，摇匀。从冷水盆中取出试管，在20℃~30℃下
放置30 min 。 向每支试管内加入0 . 2 mL
亚硝酸钠溶液(4.2.5),摇匀，放置25 min。
以试剂空白调零，在590 nm
波长处测定色氨酸标准系列溶液的吸光度值。以色氨酸浓度为横坐
标，吸光度值为纵坐标，绘制工作曲线，列出回归方程。
同时测定样品空白和试样溶液的吸光度值。
4.6.1 未脱脂试样中L- 色氨酸的含量以质量分数 w;
计，数值以克每100克表示，按式(3)计算：
style="width:2.75333in;height:0.62656in" /> (3)
式 中 ：
p —
以试样溶液吸光度值与样品空白吸光度值之差从工作曲线上查得的色氨酸含量，单位为
微克(μg);
GB/T 15400—2018
m ——试样质量，单位为克(g)。
4.6.2 脱脂试样中 L- 色氨酸的含量以质量分数 w;
计，数值以克每100克表示，按式(4)计算：
style="width:3.86002in;height:0.62678in" /> (4)
式中：
F— 脂肪含量，%。
式中其他参数同4.6.1解释。
测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留两位小数。
注：试样脂肪含量小于4%时，式(3)和式(4)所得结果在允许偏差之内。
在重复性条件下，当试样中色氨酸含量小于0.
1%时，两次独立测定结果的绝对差值应不大于
0.01%。当试样中色氨酸含量在0.1%～0.5%时，两次独立测定结果与其平均值的绝对差值，应不大于
该平均值的3%。当试样中色氨酸含量大于0.5%时，两次独立测定结果与其平均值的绝对差值，应不
大于该平均值的2%。
GB/T 15400—2018
(资料性附录)
色氨酸标准溶液色谱图
色氨酸标准溶液色谱图见图 A.1。
style="width:11.76004in;height:5.97322in" />时间/min
图 A.1 色氨酸标准溶液(30 μg/mL) 色谱图
GB/T 15400—2018
(资料性附录)
参考称样量
根据样品蛋白质、色氨酸含量确定称样量，经试验研究建议不同饲料称样量见表B.1。
表 B.1 参考称样量
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