门 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T2986—2011 马传染性子宫炎检疫技术规范 Quarantine protocolfor contagious equine metritis 2011-09-09发布 2012-04-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 数马防伤 SN/T2986—2011 前 本标准按照GB/T1.1-一2009给出的规则起草。 本标准与国际动物卫生组织（OIE）《陆生动物诊断试验和疫苗标准手册》（2010版）第2.5.2章一致 性程度为非等效。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫 局、中华人民共和国吉林出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：张伟、谷强、郑小龙、吴丹、高志强、柏亚铎、孟日增、张利峰、汪琳、蒲静、乔彩霞、 刘环、段向英、孟庆峰、张鹤晓、赖平安、王群。 SN/T2986—2011 马传染性子宫炎检疫技术规范 范围 1 本标准规定了马传染性子宫炎细菌分离培养、血清学试验、PCR鉴定的诊断方法。 本标准适用于进出境马传染性子宫炎的检疫。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T19489—2008实验室生物安全通用要求 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 CEM（contagiousequinemetritis）：马传染性子宫炎，由马生殖道泰勒氏杆菌引起的马子宫内膜炎 T.equigenitalis（Taylorellaequigenitalis）：马生殖道泰勒氏杆菌 T.asinigenitalis[Taylorellaasinigenitalis（T.equigenitalis-like）]：驴生殖道泰勒氏杆菌（类马生 殖道泰勒氏杆菌） 4试剂和材料 4.1Amies运输培养基。 4.2 CEM选择培养基。 4.3 灭菌拭子。 4.45mL冻存管。 4.5 革兰氏染色试剂。 4.6 氧化酶试剂。 4.7 CEM抗血清或单克隆抗体。 4.8 乳胶凝集试验试剂。 4.9 PCR通用试剂耗材。 5 器材和设备 5.15%~10%二氧化碳培养箱。 5.2 2高压灭菌器。 5.3显微镜。 5.4微量移液器。 5.5电泳仪。 SN/T2986-2011 5.6凝胶检测系统或凝胶检测仪。 5.7PCR仪。 5.8高速台式冷冻离心机。 6临床诊断 参见附录A。 7实验室诊断方法 培养血置于5%10%二氧化碳的烛缸或者培养箱丙35℃～37℃培养。马生殖道泰勒氏杆菌生 长至少需要培养48h才能形成菌落，48h后应每天观察。培养7d～13d观察到菌落。最初24h应检 查是否有杂菌污染。本菌菌落很小，真径2m～3mm，边缘光灌，有光泽，呈灰黄色。 马生殖道泰勒氏杆菌革差氏染色阴性，无运动性，杆状或球杆状，有时呈多态性（长达6μm），并可 表现两极着色。 7.1.3生化鉴定 马生殖道泰勒氏杆菌能产生过氧化酶和磷酸酯酶，氧化酶强阳性，其他生化反应不明确。如果所分 离的细菌生长缓慢，符合上述细菌形态，氧化酶强阳性，厕对这种细菌要用马生殖道泰勒氏杆菌特异性 抗血清进行鉴定或者PCR鉴定。 7.2血清学鉴定 血清学检测方法主要有玻片凝集试验、乳胶凝集试验、直接或间接免疫荧光试验等，实验室可以根 据本身的情况选择适当的方法（参见附录A）。 血清学鉴定为阴性的样品，可以直接判定为阴性。对于血清学阳性的结果，由于目前的检测方法还 不能证明能够区分T，equigenitalis与T.asinigentialis（T.equigenitalis-like），因此还需要采用PCR 方法进行鉴定。 7.3PCR鉴定 7.3.1样品选择 生殖道拭子类样品的采集及运输参照7.1.1，本试验也可用细菌分离的可疑菌落作为样品进行检 测。实验时，应同时设一个已知马生殖道泰勒氏杆菌培养对照。 2 SN/T2986—2011 7.3.2 引物情况 引物设计见表1。 表1引物 产物大小 病 原 引 物 bp TEQF5'-GGTTTGTGTTAATACCATGGAC-3' T.equigenitalis 406 TEQR5-TCGCTACCAAGACCCG-3" TELE GGATAATACC CTAGGA-3" Tris-HCI(pH 8.3) 10mmbl/l dNTP 100μmol/L MgCl2 7.5mmo1/L 二甲基亚砜 2μL Taq酶 2.5U 用无核酸水补充至50μL体积。 7.3.4.2阳性对照 模板为标准菌株阳性菌落提取的DNA或经验证的预先提好的阳性菌DNA。 DNA模板 2μL(10ng/mL) 引物（POSF、POSR每种） 0.75μmol/L KCI 50mmol/L Tris-HCI(pH8.3) 10mmol/L 3 SN/T2986—2011 dNTP 100μmol/L MgCl2 1.5mmol/L 二甲基亚矾 2 μL Taq酶 2.5 U 用无核酸水补充至50μL体积。 7.3.5PCR反应条件 双重PCR和阳性对照使用相同的反应条件，具体如下： 95℃，10min；95℃，1min，56℃1min，35个循环72℃2min。 PCR产物经2%的琼脂糖凝胶电泳（溴化乙锭或者其替代产品染色），用凝胶检测系统或凝胶检测 仪检测。试验成立的前提是阳性对照组有1500bp的电泳条带，否则试验不成立。在阳性对照成立的 前提下，如果只出现406bp的电泳条带，则为马生殖道泰勒氏杆菌阳性，如果只出现706bp的电泳条 带，则为T.asinigentialis（T.equigenitalis-like）阳性，如果同时出现406bp和706bp的电泳条带，则为 两种病原双阳性。如果均无目的条带产生则两种病原均为阴性。 8结果判定 CEM的实验室确诊是通过细菌分离培养结合生化鉴定、血清学鉴定（可选，但不能确诊）以及PCR 鉴定进行的。其中生化鉴定以及血清学鉴定不能完全确诊分离的病原是T.equigenitalis还是 T.asinigentialis(T.equigenitalis-like)。 细菌分离培养、生化鉴定以及血清学鉴定其中任何一个试验的结果为阴性，则可以不进行后续的试 验，直接出具阴性的结果报告。 细菌分离培养阳性，同时PCR鉴定为T.equigenitalis阳性的样品为马传染性子宫炎阳性。 4 SN/T2986—2011 附录A （资料性附录） 马传染性子宫炎简介 A.1症状及控制 马传染性子宫炎是由马生殖道泰勒氏杆菌引起的马子宫内膜炎，通常引起暂时性不孕症。本病无 全身性临床症状，只侵害母马生殖道。英国于1977年首次报道马传染性子宫炎，随后在整个欧洲、北 美、澳大利亚及其他许多国家发生。 主要临床症状是不同程度的宫颈炎和阴道炎，阴道有轻度黏脓性分泌物流出。病马可逐渐康复，但 多数成为长期的无症状的带菌者。主要通过与带菌种马交配而感染，病菌主要定居于泌尿生殖道黏膜 （尿道隐窝、尿道或者阴茎鞘）；也能通过冲洗或检查母马生殖道时操作不卫生而传播。带菌母马所携带 的病菌定居于泌尿生殖道黏膜，特别是阴蒂窦、隐窝和子宫等部位的黏膜。带菌母马产下的马驹也可能 成为带菌者。病菌不仅侵害马，而且可以侵害其他马属动物，如驴。 用消毒剂冲洗，结合局部和全身抗菌治疗，可以清除所带病菌，但免疫接种无效。 控制本病的主要方法是建立无感染种群后再开始紧殖。确定是否被感染的方法，主要是取公马和 母马的泌尿生殖道拭子进行病菌分离培养，并对之进行鉴定。针对马生殖道泰勒氏杆菌的血清抗体，可 从母马体内检出，但为期仅在感染后3周～7周内；少数带菌母马也可检出抗体，但在公马检不到。因 此，血清学试验对手检查母马近期而非性感染是有价值的。然而，控制本病的重点应该是通过分离培 养检出带菌者。 A.2病原鉴定 应小心谨慎地将拭子送往实验室，以免病菌失活。培养马生殖道泰勒氏杆菌至少需要72h，有时长 达13d，但用巧克力培养基，在5%～10%二氧化碳培养箱内37℃下培养，最多需要6d。标准的培养时 间为7d。本菌在适宜条件下培养72h后，形成直径为2mm～3mm的小菌落，呈露滴样透明和灰黄 色，边缘光滑。它是一种革兰氏阴性的小球杆状细菌，有时呈多态性，呈现两极着色。能产生过氧化氢 酶和磷酸酯酶，氧化酶强阳性。无其他生化反应，有赖于用特异性抗体对细菌的抗原性进行鉴定。 可以使用灭活的马生殖道泰勒氏杆菌制备抗全菌体的抗体并用此抗体制备乳胶凝集试验试剂盒。 但是，关键是有特异性，与马生殖道存在的其他氧化酶/过氧化氢酶阳性、革兰氏阴性细菌不发生交叉反 应。已研制出单克隆抗体，并成功地用于鉴定马生殖道泰勒氏杆菌。最近，美国从公驴分离到一种类马 生殖道泰勒氏杆菌的细菌，该菌无致病性，只存在于公驴的生殖道，可经交配传播至其他马属动物；菌落 形态和生化反应与马生殖道泰勒氏杆菌相似，甚至两者有血清学交叉反应，对它的存在和意义应引起各 实验室的注意。 A.3血清学试验 至今尚没有可靠的血清学方法用于本病的诊断和控制。然而，血清学试验可作为分离培养的一种 辅助方法，用于筛检近期可能曾与公马交配过的母马，但其决不能替代分离培养。 用于鉴定的血清学方法很多，有简单的如玻片凝集试验，也有复杂的直接或间接免疫荧光试验，各 种方法都有优缺点。玻片凝