团 体 标 准 食品中单核细胞增生李斯特 氏菌和金黄色葡萄球菌的快 速检测（聚合酶螺旋反应 法，PSR） Rapid method for the detection of Listeria monocytogenes and Staphylococcus aureus in foods (polymerase spiral reaction, PSR) 安徽省食品科学技术学会 发布T/AHFS 006-2024 ICS 07.100.30 CCS C 50 2024-09-19发布 2024-10-19实施 全国团体标准信息平台 T/AHFS 006-2024 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件 的结构和起草规则 》的规定起 草。 本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本文件由 安徽国泰众信检测技术有限公司 提出。 本文件由 安徽省食品科学技术学会 归口管理。 本文件起草单位： 安徽国泰众信检测技术有限公司、南京财经大学、浙江省质量科学研究院 、安徽 省食品药品检验研究院、马鞍山市食品药品检验和药品不良反应监测中心 。 本文件主要起草人： 陈洪周、陆颖健、李琦、张莫然、庞心怡、孙静、李向菲、黄嘉明、姚杰、张 媛、曹品品、 段佳丽、 吴鹏、安虹、汪强、王兆明 。 全国团体标准信息平台 T/AHFS 006-2024 1 食品中单核细胞增生李斯特氏菌和金黄色葡萄球菌的快速检测（聚 合酶螺旋反应法， PSR） 1 范围 本文件规定了 食品中单核细胞增生李斯特氏菌（ Listeria monocytogenes ）和金黄色葡萄球菌 （Staphylococcus aureus ）的聚合酶螺旋反应（ PSR）快速检测方法 。 本文件适用 于食品中单核细胞增生李斯特氏菌和金黄色葡萄球菌的快速检测 。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 4789.10 食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验 GB 4789.30 食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本 文件。 3.1 聚合酶螺旋反应 （Polymerase spiral reaction ，PSR) 聚合酶螺旋反应，简称 PSR，是一种新型恒温核酸扩增技术。利用 2～4条特异性引物和具有链置换 活性的 Bst DNA聚合酶，可在恒温条件下完成对靶基因的快速扩增。因具有引物设计简单、扩增效率高 且不需昂贵设备等优点而取得良好的应用效果。其体系内包含： Tris-HCl、硫酸铵、氯化钾、硫酸镁、 Tween 20 、甜菜碱、 dNTP、Bst DNA聚合酶及特异性的两对引物。检测体积 25 μL，45 min内完成检测， 适用于现场检测。 4 缩略语 下列缩略语 适用于本文件： DNA：脱氧核糖核苷酸（ deoxyribonucleic acid ） dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（ deoxyribonucleoside triphosphate ） Tris：三羟甲基氨基甲烷 [tris(hydroxymethyl)aminomethane] HNB：羟基萘酚蓝（ hydroxynaphthol blue ） 5 原理 待测目标经增菌并提取 DNA后，在聚合酶螺旋反应体系内加入 1 μL -2 μL（20 ng -100 ng）DNA，在 恒温 65℃下反应 30-60 min即可完成扩增。基本扩增原理为：在高浓度甜菜碱的作用下，诱导 DNA单链 和双链之间处于动态平衡。此外，利用 Bst DNA 5'→3'聚合酶活性和链置换活性不断使新合成的产物变 全国团体标准信息平台 T/AHFS 006-2024 2 性。随后，允许引物与目标片段结合，便于完成核酸扩增。与其他恒温核酸扩增系统相比， PSR引物设 计较为简单且为单酶系统，以此提高反应稳定性来简化过程。可使用实时荧光和琼脂糖凝胶电泳验证检 测结果。该法也可以与羟基萘酚蓝等颜色指示剂联用，从而完成肉眼对扩增结果的判读。羟基萘酚蓝是 一种金属离子指示剂，可与反应体系当中的镁离子结合而成紫罗兰色，当 核酸大量合成时，从 dNTPs析 出的焦磷酸根离子与反应缓冲液中的镁离子结合，生成焦磷酸镁，失去镁离子的羟基萘酚蓝就变成了天 蓝色。 6 仪器与设备 6.1 冰箱：冷藏温度（ 2℃-4℃）、冷冻温度（ -20℃）。 6.2 培养箱： 36℃± 1℃。 6.3 微型涡旋仪。 6.4 超净工作台。 6.5 超微量分光光度计。 6.6 金属浴加热器 (37℃ )。 6.7 水平电泳仪。 6.8 全自动化学发光图像分析系统。 6.9 实时荧光定量 PCR仪。 6.10 微量移液器： 0.5 μL-10 μL、0.1 μL-2.5 μL、10 μL-100 μL。 7 试剂与材料 7.1 质控菌株 表1 质控菌株 序号 菌株名称 拉丁文 菌株编号 备注 1 单核细胞增生李斯特氏菌 Listeria monocytogenes CICC 21635 阳性菌株 2 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus CICC21600 阳性菌株 3 大肠杆菌 O157:H7 Escherichia coli CICC 21530 阴性菌株 4 蜡样芽孢杆菌 Bacillus cereus CMCC 63301 阴性菌株 5 肠炎沙门氏菌 Salmonella enteritidis CICC 21482 阴性菌株 6 鼠伤寒沙门氏菌 Salmonella typhimurium CICC 21483 阴性菌株 7 福氏志贺菌 Shigella flexneri CMCC 51571 阴性菌株 8 副溶血性弧菌 Vibrio parahemolyticus CICC 21528 阴性菌株 9 创伤弧菌 Vibrio vulnificus ATCC 27562 阴性菌株 7.2 聚合酶螺旋反应试剂（ -20℃保存） Isothermal buffer （10×，200 mM Tris -HCl，500 mM 氯化钾， 100 mM 硫酸铵， 20 mM 硫酸镁和 1% Tween 20 ）；硫酸镁（ 100 mM，RG）； dNTP（10 mM）；甜菜碱（ 5 M，RG）； Bst 2.0 WarmStart ® DNA 聚合酶（ 8,000 U/mL）； Evegreen （20×）；羟基萘酚蓝指示剂（ 3 mM）。 7.3 其他试剂 细菌DNA提取试剂盒，包括细菌 DNA提取试剂、溶菌酶、 RNase和蛋白酶 K。 全国团体标准信息平台