声明

本文是学习GB-T 18646-2018 动物布鲁氏菌病诊断技术. 而整理的学习笔记,分享出来希望更多人受益,如果存在侵权请及时联系我们

1 范围

本标准规定了动物布鲁氏菌病的临床诊断、血清学和病原学诊断的技术方法、操作程序和判定

标准。

本标准规定的流行特点、临床症状、病理变化适用于动物布鲁氏菌病的临床诊断。
虎红平板凝集试验和间接酶联免疫吸附试验，适用于动物布鲁氏菌病的初筛试验；

乳牛全乳环状试验，适用于泌乳母牛布鲁氏菌病的初筛试验；

试管凝集试验、补体结合试验和竞争酶联免疫吸附试验适用于牛种、羊种和猪种布鲁氏菌病的血清

学确诊；

病原的显微镜检查、分离培养适用于布鲁氏菌病的病原学初步诊断；病原的鉴定和
PCR 试验适用

于动物布鲁氏菌病的病原学确诊。

本标准规定的乳牛全乳环状试验，不适用于检测患乳房炎及其他乳房疾病母牛的乳、初乳、脱脂乳

和煮沸过的乳，也不适用于腐败、变酸和冻结过的乳。

本标准规定的虎红平板凝集试验、试管凝集试验和补体结合试验，不适用于犬种和绵羊附睾种布鲁

氏菌的检测。

2 规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T 18088 出入境动物检疫采样

GB 19489—2008 实验室生物安全通用要求

3 缩略语

下列缩略语适用于本文件。

OIE 世界动物卫生组织(World Organization tor Animal Health(英),Office Intentional des Epi-

zootic(法))

RBT 虎红平板凝集试验(Rose Bengal Test)

MRT 乳牛全乳环状试验(Milk Ring Test)

SAT 试管凝集试验(Serum Agglutination Test)

CFT 补体结合试验(Complement Fixation Test)

iELISA 间接酶联免疫吸附试验(Indirect Enzyme Linked Immunosorbent
Assay)

cELISA 竞争酶联免疫吸附试验(Competitive Enzyme Linked Immunosorbent
Assay)

PCR 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)

DNA 脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid)

dNTPs 脱氧核苷三磷酸(Deoxy-Ribonucleoside Triphosphate)

TBE 三羟甲基氨基甲烷硼酸乙二胺四乙酸缓冲液(Tris Boric Acid EDTA)

GB/T 18646—2018

HRP 辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase)

4 诊断方法

4.1 流行特点

多种动物对布鲁氏菌易感，羊、牛、猪的易感性最强。母畜比公畜易感，成年畜比幼年畜易感。动物

的易感性随着性成熟年龄接近而增高，在母畜中，第一次妊娠母畜发病较多。

患病和带菌动物是主要传染源，尤其是感染的妊娠母畜，在流产或分娩时将大量的布鲁氏菌随着胎

儿、胎水和胎衣排出，流产后的阴道分泌物和乳汁中都含有布鲁氏菌。

布鲁氏菌病的传播途径主要是消化道，也可通过皮肤、黏膜、交配等感染，蜱的叮咬可传播本病。

布鲁氏菌病呈现明显的接触传播特征，通过直接接触或间接接触均可造成传播，在牧区或农牧区多
发，疾病的发生不具有明显的季节性，在有感染的群体内呈扩散传播特点。
一般为散发，羊种布鲁氏菌

病可呈地方流行性发生。

4.2 临床症状

潜伏期一般为14 d～180 d。

显著症状是妊娠母畜发生流产，流产后可能发生胎衣滞留和子宫内膜炎，从阴道流出污秽不洁、恶
臭的分泌物。新发病的畜群流产较多；老疫区畜群发生流产的较少，但发生子宫内膜炎、乳房炎、关节

炎、局部脓肿、胎衣滞留、久配不孕的较多。公畜往往发生睾丸炎、附睾炎或关节炎。

4.3 病理变化

警示——对本病剖检采样过程当中应当防止病原微生物扩散和感染。

主要病变为妊娠或流产母畜子宫内膜和胎衣的炎性浸润、渗出、出血及坏死，有的可见关节炎。胎

儿主要呈败血症病变，浆膜和黏膜有出血点和出血斑，皮下结缔组织发生浆液性、出血性炎症。

组织学检查可见脾、淋巴结、肝、肾等器官形成特征性肉芽肿。

4.4 虎红平板凝集试验(RBT)

4.4.1 器材

微量移液器，灭菌移液器吸头、牙签或混匀棒，计时器，洁净的玻璃板(其上划分成4
cm² 的方格)。

4.4.2 试剂

商品化的布鲁氏菌虎红平板凝集试验抗原、布鲁氏菌标准阳性血清和布鲁氏菌标准阴性血清。

4.4.3 操作方法

4.4.3.1 按常规方法采集和分离受检血清。

4.4.3.2
将受检血清、布鲁氏菌标准阴、阳性血清和抗原从冰箱取出平衡至室温。

4.4.3.3 涡旋混匀血清和抗原，分别吸取25 μL
的血清和抗原加于玻璃板4 cm² 方格内的两侧。

4.4.3.4
用灭菌牙签或混匀棒快速混匀血清和抗原，涂成2 cm 直径的圆形，混匀后4
min, 在自然光下

观察。

4.4.3.5 试验应设标准阴、阳性血清对照。

4.4.4 结果判定

4.4.4.1
在标准阴性血清不出现凝集、标准阳性血清出现凝集时，试验成立，方可对受检血清进行判定。

GB/T 18646—2018

4.4.4.2
出现肉眼可见凝集现象者判定为阳性(十),无凝集现象且反应混合液呈均匀粉红色者判定为

阴性(一)。

4.5 乳牛全乳环状试验(MRT)

4.5.1 器材

微量移液器，灭菌移液器吸头，内径为1 cm 的灭菌试管。

4.5.2 试 剂

商品化布鲁氏菌全乳环状试验抗原。

4.5.3 乳样

受检乳样应为新鲜的全乳，或混合奶；采乳样时应将乳牛的乳房用温水洗净、擦干，然后将乳汁(前

三把乳不作为检测用)挤入洁净的器皿中；采集的乳样夏季时应于当日内检测。

4.5.4 操作方法

4.5.4.1
将乳样和布鲁氏菌全乳环状试验抗原平衡至室温。

4.5.4.2 取乳样1000μL, 加于灭菌凝集试管内。

4.5.4.3
取充分振荡混合均匀的布鲁氏菌全乳环状试验抗原50 μL 加入乳样中充分混匀。

4.5.4.4 置37℃~38℃水浴中孵育60 min。

4.5.4.5 孵育后取出试管勿使振荡，立即进行判定。

4.5.5 结果判定

结果判定如下：

a)
强阳性反应(+++),乳柱上层乳脂形成明显红色的环带，乳柱白色，临界分明；

b) 阳性反应(++),乳脂层的环带呈红色，但不显著，乳柱略带颜色；

c) 弱阳性反应(+),乳脂层的环带颜色较浅，但比乳柱颜色略深；

d) 疑似反应(士),乳脂层的环带颜色不明显，与乳柱分界不清，乳柱不褪色；

e) 阴性反应(一),乳柱上层无任何变化，乳柱颜色均匀。

4.6 试管凝集试验(SAT)

4.6.1 微量法

4.6.1.1 器材

96孔 U
型聚苯乙烯板、微量移液器、灭菌移液器吸头、塑料薄膜、湿盒、振荡器、适宜的稀释用器皿

及温箱(37℃±1℃)。

4.6.1.2 试剂

商品化试管凝集试验抗原、布鲁氏菌标准阳性血清、布鲁氏菌标准阴性血清、稀释液为含0.5%石炭
酸的生理盐水(用于检验牛血清时稀释血清和抗原)或含0.5%石炭酸的10%氯化钠溶液(用于检验羊

血清时稀释血清和抗原)。

4.6.1.3 操作方法

4.6.1.3.1 按常规方法采集和分离受检血清。

GB/T 18646—2018

4.6.1.3.2 受 检 血 清 的 稀 释 ：

a) 以羊血清为例，每份血清用4个连续的 U 型孔；

b) 在聚苯乙烯反应板的第1孔加184 μL 稀释液；

c) 第2孔～4孔各加入100 μL 稀释液；

d) 用微量移液器取受检血清16μL;加入第1孔，并混匀；

e) 从第1孔吸取100 μL
混合液加入第2孔充分混匀，如此倍比稀释至第4孔，从第4孔弃去混 合液100μL;

f) 稀释完毕，从第1至第4孔的血清稀释度分别为1:12.5、1:25、1:50和1:100;

g) 牛血清稀释法与上述基本一致，差异是第1孔加192 μL 稀释液和8 μL
受检血清，其稀释度分 别为1:25、1:50、1:100和1:200。

4.6.1.3.3 分别取按说明书要求稀释的抗原100μL
加入上述各孔稀释好的血清中，并振荡混匀，羊的
血清稀释度则依次变为1:25、1:50、1:100和1:200,牛的血清稀释度则依次变为1:50、1:100、
1:200和1:400。

4.6.1.3.4
将加完样的聚苯乙烯反应板各孔用塑料薄膜严密封盖后，放湿盒内置温箱(37℃±1℃)孵
育18 h～24 h,取出检查并记录结果。

4.6.1.3.5 每次试验均应设阳性血清对照、阴性血清对照和抗原对照，即：

a)
阴性血清对照：冻干阴性血清按说明书稀释到规定容量后，对照试验中稀释和加抗原的方法与
受检血清相同；

b)
阳性血清对照：冻干阳性血清按说明书稀释到规定容量后，对照试验中稀释和加抗原的方法与
受检血清相同；

c) 抗原对照：抗原按说明书稀释到规定容量，取100μL, 再加100 μL
稀释液，观察抗原是否有自 凝现象。

4.6.1.4 结果判定及处理

4.6.1.4.1 凝集反应程度

凝集反应程度分为5个等级，分别记为“++++""+++""++”"+""一
",按以下说明判定：

a) + 十+十：菌体完全凝集，1孔～4孔凝集物呈伞状均匀铺于孔底；

b) +
十十：菌体几乎完全凝集，1孔～3孔凝集物呈伞状均匀铺于孔底，第4孔孔底呈现白色
点状；

c) +
十：菌体凝集显著，1孔～2孔凝集物呈伞状均匀铺于孔底，3孔～4孔孔底呈现白色点状；

d)
十：凝集物有沉淀，第1孔凝集物呈伞状均匀铺于孔底，2孔～4孔孔底呈现白色点状；

e) 一：无凝集，1孔～4孔孔底均呈现白色点状。

4.6.1.4.2 结果判定

当阳性血清出现完全凝集(十十++),而阴性血清无凝集(一),抗原对照无自凝(一)现象时，试验

成立，按以下对试验结果判定：

a) 受检血清出现"++"及以上凝集现象时，判定为阳性；

b) 受检血清出现"+"凝集现象时，判定为可疑；

c) 受检血清出现"一"时，判定为阴性。

4.6.1.4.3 可疑结果的处理

试验结果可疑牛、羊经30 d 后采血重检，如果仍为可疑，该家畜判为阳性。

GB/T 18646—2018

4.6.2 常量法

4.6.2.1 器材

玻璃试管、试管架、移液器、灭菌移液器吸头及温箱(37℃±1℃)。

4.6.2.2 试剂

商品化布鲁氏菌试管凝集试验抗原、布鲁氏菌标准阳性血清和布鲁氏菌标准阴性血清、稀释液为含
0.5%石炭酸的生理盐水和(或)含0.5%石炭酸的10%氯化钠溶液(用于检验羊血清时稀释血清和抗

原)。

4.6.2.3 操作方法

4.6.2.3.1 按常规方法采集和分离受检血清。

4.6.2.3.2 受检血清的稀释：

a) 以羊和猪血清为例，每份血清用4支凝集试管；

b) 第1管标记检验编码后加920 μL 稀释液；

c) 第2管～4管各加入500μL 稀释液；

d) 然后取受检血清80μL,加入第1管内，并混合均匀；

e) 取500 μL
混合液加入第2管并充分混匀，如此倍比稀释至第4管，从第4管弃去混匀液
500μL;

f) 稀释完毕，从第1至第4管的血清稀释度分别为1:12.5、1:25、1:50和1:100;

g) 牛、马、鹿、骆驼血清稀释法与上述基本一致，差异是第一管加960 μL
稀释液和40 μL 受检血 清，其稀释度分别为1:25、1:50、1:100和1:200。

4.6.2.3.3 将按说明书要求稀释的抗原液500 μL
分别加入已稀释好的各管血清中，并振摇均匀，羊和
猪的血清稀释度则依次变为1:25、1:50、1:100和1:200,牛、马和骆驼的血清稀释度则依次变为
1:50、1:100、1:200和1:400。

大规模检疫时也可只用2个血清稀释度(加抗原后的终稀释度),即牛、马、鹿、骆驼用1:50
和

1:100,猪、山羊、绵羊和犬用1:25和1:50。

4.6.2.3.4 每次试验均应设阳性血清、阴性血清和抗原对照，即：

a)
阴性血清对照：冻干阴性血清按说明书稀释到规定容量后，对照试验中稀释和加抗原的方法与
受检血清相同；

b)
阳性血清对照：冻干阳性血清按说明书稀释到规定容量后，对照试验中稀释和加抗原的方法与
受检血清相同；

c) 抗原对照：按说明书要求稀释抗原液500μL,再加500 μL
稀释液，观察抗原是否有自凝现象。

4.6.2.3.5 将加样后的试管置温箱(37℃±1℃)孵育18 h～24
h,取出检查并记录结果。

4.6.2.4 结果判定及处理

4.6.2.4.1 凝集反应程度

凝集反应程度应根据参照比浊管(制备方法见附录 A) 来 判 读 ， 分 别 记 为
" + + + + " " + + + " "++""+""一 ",按以下说明判定：

a) ++++ 菌体完全凝集，100%下沉，上层液体100%清亮；

b) +++ 菌体几乎完全凝集，上层液体75%清亮；

c) ++ 菌体凝集显著，液体50%清亮；

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d) + 有凝集物沉淀，液体25%清亮；

e) 一无凝集物，液体均匀混浊。

4.6.2.4.2 试验成立条件及结果判定

当阳性对照血清出现完全凝集(++++),阴性对照血清无凝集(一),抗原对照无自凝(一)现象

时，试验成立，可对结果进行如下判定：

a)
牛、马、鹿和骆驼1:100血清稀释度，猪、山羊、绵羊和犬1:50血清稀释度，出现"++"及以
上凝集现象时，判定为阳性；

b)
牛、马、鹿、骆驼1:50血清稀释度，猪、山羊、绵羊和犬1:25血清稀释度，出现"++"以上凝
集现象时，判定为可疑。

4.6.2.4.3 结果处理

试验结果可疑的家畜经30 d
后采血重检，如果仍为可疑，该牛、羊判为阳性。猪和马经重检仍保持

可疑水平，而农场的牲畜没有临床症状和大批阳性患畜出现，该畜判为阴性。

猪血清偶有非特异性反应，应结合流行病学调查判定，必要时配合补体结合试验和鉴别诊断，排除

耶森氏菌交叉凝集反应。

4.7 补体结合试验(CFT)

4.7.1 微量法

4.7.1.1 器材

96孔聚苯乙烯板、微量移液器、灭菌移液器吸头、离心机、稀释用器皿、温控范围为37℃~38℃和

54 ℃~64 ℃水浴锅、计时器。

4.7.1.2 试剂及其制备

4.7.1.2.1 稀释液

巴比妥缓冲液(pH7.2), 配制方法见附录B。

4.7.1.2.2 受检血清

其采集和处理见附录 B。

4.7.1.2.3 绵羊红细胞悬液

采取成年公绵羊血，按常规方法脱纤、洗涤、离心，用稀释液洗涤至上清无色为止，最后一次以2000
r/min

离心沉淀10 min,取下沉的红细胞沉积物，以稀释液配制成2.5%红细胞悬液(2.5
mL/100 mL)。

4.7.1.2.4
商品化布鲁氏菌补体结合试验抗原、布鲁氏菌标准阳性血清、布鲁氏菌标准阴性血清

商品化布鲁氏菌补体结合试验抗原在有效期内按说明书稀释，稀释前需震荡混匀。

4.7.1.2.5 商品化溶血素

商品化溶血素在有效期内根据标示效价使用，对每批次溶血素都需要进行效价测定，方法见附录
C。
将100%溶血的最高稀释度所用溶血素作为一个单位溶血素工作效价，试验中用2倍溶血素工作

效价。

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4.7.1.2.6 商品化冻干补体

除使用商品化冻干补体外，也可使用新鲜豚鼠血清作为补体。补体制备及效价测定方法见附录
D。
一个单位体积的标准红细胞悬液中50%红细胞发生溶解的补体量为一个补体单位，试验中用6倍补体

工作效价。

4.7.1.3 操作方法

4.7.1.3.1 受检血清的前处理

按常规方法采集、分离和灭能受检血清，见附录 B。

4.7.1.3.2 血清样品稀释

96孔板第1、2排作为血清抗补体对照，血清稀释度为1/2、1/4;从第3排到第8排血清样品稀释度

分别为1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64,按如下步骤操作：

a) 第1排每孔分别加50μL
稀释液，第2、4、5、6、7、8排每孔分别加稀释液25μL;

b) 第1排每孔加50μL 灭能血清，混匀后吸取25 μL
加入其后的第2排孔，混匀后弃去25μL;

c) 从第1排孔混匀液体中先后各吸取25 μL
分别加入同列的第3、4排孔，混匀；

d) 从第4排起倍比稀释，即从第4排孔吸取液体25 μL
到同列第5排孔，混匀，以此类推到第

8 排 ；

e) 第8排孔吸取25μL 液体弃去。

4.7.1.3.3 加抗原

除第1、2排外，上述每孔分别加工作量抗原25μL。

4.7.1.3.4 加补体

上述每孔分别加工作量补体25μL,轻轻混匀，置4℃孵育过夜或37℃孵育30 min。

4.7.1.3.5 制备致敏红细胞

将2.5%红细胞及溶血素等体积混匀至室温20 min。

4.7.1.3.6 复温孵育

将4.7.1.3.4中孵育过夜的96孔板从冰箱取出置37℃孵育10 min。

4.7.1.3.7 加致敏红细胞

上述每孔加入50 μL 致敏红细胞，轻轻混匀，37℃孵育30 min。

4.7.1.3.8 细胞沉降

室温300g 离心5 min～10 min或者在4℃放置2 h～3h
让细胞自然沉降，观察判定。

4.7.1.3.9 设立对照及主试验各要素的添加

每次试验需设阳性血清、阴性血清、抗原、致敏红细胞和补体对照。主试验各要素添加量和顺序如

GB/T 18646—2018

表1所示。

表 1 布鲁氏菌病补体结合试验的主试验 单位为微升

4.7.1.4 结果判定

4.7.1.4.1
试验成立条件：阴性血清对照、阴性血清抗补体对照、阳性血清的抗补体对照、抗原对照和补
体对照呈完全溶血反应，致敏红细胞对照呈完全抑制溶血。

4.7.1.4.2
上述对照正确无误后即可对受检血清进行判定。受检血清的判定参照溶血标准比色记录结
果，溶血标准比色孔的制备方法见附录 E。

4.7.1.4.3 按表2判定，溶血抑制程度≥20 IU/mL 判为阳性。

表 2 微量补体结合试验判定标准

GB/T 18646—2018

4.7.2 常量法

4.7.2.1 器材

内口径1 cm
玻璃试管、试管架、移液器、灭菌移液器吸头、适宜的稀释用器皿及温控范围为37℃~

38 ℃和54 ℃~64 ℃水浴锅。

4.7.2.2 试剂及其制备

4.7.2.2.1 稀释液

0.85%生理盐水。

4.7.2.2.2 受检血清

受检血清的采集和处理见附录B。

4.7.2.2.3 绵羊红细胞悬液

采取成年公绵羊血，按常规方法脱纤、洗涤、离心，用稀释液洗涤至上清无色为止，最后一次以

2000 r/min 离心沉淀10
min,取下沉的红细胞沉积物，以稀释液配制成2.5%红细胞悬液(2.5 mL/100 mL)。

4.7.2.2.4 标准血清

商品化布鲁氏菌标准阳性血清、布鲁氏菌标准阴性血清。

4.7.2.2.5 溶血素

商品化溶血素在有效期内根据标示效价使用，如需进行效价测定见附录 C。

4.7.2.2.6 补体

除使用商品化冻干补体外，也可使用新鲜豚鼠血清作为补体。补体制备方法见附录
D。

4.7.2.2.7 抗原

商品化抗原在有效期内根据标示效价使用，如需进行效价测定见附录F。

4.7.2.3 操作方法

4.7.2.3.1 按常规方法采集和分离受检血清。

4.7.2.3.2 将1:10稀释受检血清灭能(见附录 B)
后，分别加入2支玻璃试管内，每管500μL。

4.7.2.3.3 其中一管加工作量抗原500μL, 另一管加稀释液500 μL。

4.7.2.3.4 上述2管均加工作量补体，每管500μL, 振荡混匀。

4.7.2.3.5 置37℃水浴20 min,
取出放于室温环境中。每管各加2单位的溶血素500μL 和2 . 5%红细
胞悬液500μL。 充分振荡混匀。

4.7.2.3.6 再置37℃水浴20 min, 之后取出立即进行第一次判定。

4.7.2.3.7
每次试验应设阳性血清、阴性血清、抗原、溶血素和补体对照。主试验各要素添加量和顺序

如表3。

GB/T 18646—2018

表 3 布鲁氏菌病补体结合试验的主试验 单位为微升

4.7.2.4 判定

4.7.2.4.1
试验成立条件：第一次判定，不加抗原的阳性血清对照管，不加或加抗原的阴性血清对照管，
抗原对照管呈完全溶血反应。初判后静置12 h
作第二次判定，第二次判定时溶血素对照管，补体对照 管应呈完全抑制溶血。

4.7.2.4.2
对照正确无误即可对受检血清进行判定，受检血清加抗原管的判定参照标准比色管记录结
果。标准比色管的制备方法见附录 E。

4.7.2.4.3 结果判定：

a) 0～40% 溶血判为阳性反应；

b) 50%～90% 溶血判为可疑反应；

c) 100% 溶血判为阴性反应。

牛、羊和猪补体结合反应判定标准均相同。

4.8 间接酶联免疫吸附试验(iELISA)

实验室可按下列方法进行实验操作和结果判定，或根据商品化试剂盒进行实验操作和结果判定。

4.8.1 器材

96微孔聚苯乙烯板，单道移液器，多道移液器，灭菌移液器吸头，酶标仪或分光光度计，具备414
nm

或405 nm 波长的滤光片，旋转振荡器，保湿盒，盖板，洗板机等。

4.8.2 试剂

4.8.2.1 牛种布鲁氏菌 S1119-3 株或 S99
株脂多糖抗原，抗原的提取和包被见附录 G。

4.8.2.2
商品化酶标多克隆抗体(兔抗牛或免抗羊)或酶标单克隆抗体，见附录 H。

4.8.2.3
商品化布鲁氏菌标准阳性血清和标准阴性血清。

4.8.2.4 抗原包被缓冲液：0.05 mol/L 的 pH9.6
碳酸盐/碳酸氢盐缓冲体系，配制方法见附录 I 的 I.1。

4.8.2.5 稀释缓冲液(用于稀释酶标抗体和血清mol/L 的 pH7.2 磷酸盐缓冲体系 PBST1, 配 制 方法见 I.2。

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4.8.2.6 洗涤缓冲液：0.01 mol/L 的 pH7.2
磷酸盐缓冲体系 PBST2, 配制方法见I.3。

4.8.2.7 底物溶液：3%过氧化氢溶液，配制方法见 I.4。

4.8.2.8 底物缓冲液：pH4.5 柠檬酸缓冲液，配制方法见
I.5。

4.8.2.9 显色液：0.16 mol/LABTS(2,2-
二氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸))溶液，配制方法见I.6。

4.8.2.10 终止液：0.5 mol/L 叠氮化钠，配制方法见
I.7。

4.8.3 操作方法

4.8.3.1 所有待检血清和对照血清吸取25 μL 加 至 1 mL
血清稀释液中做1/40初始稀释。

4.8.3.2 取包被酶标板，每孔加入80μL 稀释液。

4.8.3.3 在第1列～10列的各孔分别加入20 μL
初始稀释的待检血清(终稀释度为1/200),在第11列 的各孔分别加入20 μL
初始稀释的阳性对照血清，在第12列的前7个孔分别加入20μL 初始稀释的阴
性对照血清，第12列的最后1孔不加入稀释缓冲液做空白对照(见图1)。

说 明 ：

B—空白对照孔；

T— 待检血清孔；

style="width:4.66667in;height:3.18056in" />

+ — 阳性对照孔；

— — 阴性对照孔。

图 1 酶标板微孔排列示意

4.8.3.4 酶标板加盖，在旋转振荡器上室温孵育30 min
(或30℃静置1h)。

4.8.3.5
甩出微孔中的液体，用洗涤液润洗5次，在吸水纸巾上反复拍打酶标板，确保酶标板各孔内无
残留液体。

4.8.3.6 每孔加入100 μL
用稀释液稀释至工作浓度的酶标抗体结合物溶液，加盖在旋转振荡器上室温
孵育30 min (或30℃静置1 h)。

4.8.3.7 按4.8.3.5 进行洗涤。

4.8.3.8 每孔加入100μL
配制好的底物显色混合液(混合液配制见 I.6), 在旋转振荡器上室温孵育

10 min～15 min。

4.8.3.9 每孔加入100 μL
终止液。用吸水纸巾吸去酶标板底部的水珠，在酶标仪405 nm 测定吸光度 (OD)
值。

4.8.4 结果判定

4.8.4.1 实验成立的条件：

a) 空白对照孔的 OD 值和7个阴性对照孔的平均 OD 值应\<0.
100,8个阳性孔的平均 OD 值应 >0.700;

b) 结合率应≥10,结合率计算按式(1)。

style="width:4.76012in;height:0.63998in" /> ………………………… (1)

GB/T 18646—2018

4.8.4.2 判定：8个阳性对照孔的平均OD
值×10%定为阴阳性的临界值。待检血清的OD 值≥临界值

判为阳性，待检血清的 OD 值\<临界值判为阴性。

4.9 竞争酶联免疫吸附试验(cELISA)

实验室可按下列方法进行实验操作和结果判定，或根据商品化试剂盒进行实验操作和结果判定。

4.9.1 器材

96微孔聚苯乙烯板，单道移液器，多道移液器，灭菌移液器吸头，酶标仪或分光光度计，具备450
nm

波长的滤光片，微量振荡器，旋转振荡器，保湿盒，盖板，洗板机等。

4.9.2 试剂

4.9.2.1 牛种布鲁氏菌 S1119-3 或羊种布鲁氏菌16 M(M
表位)脂多糖抗原，抗原的提取和包被见附

录G。

4.9.2.2 酶标单克隆抗体，见附录 H。

4.9.2.3 商品化布鲁氏菌标准阳性血清和标准阴性血清。

4.9.2.4 稀释缓冲液(用于稀释结合物
pH7.2磷酸盐缓冲体系(PBST1), 配制方法见I.2。

4.9.2.5 洗涤缓冲液：0.01 mol/L
磷酸氢二钠缓冲溶液(PBST2), 配制方法见I.3。

4.9.2.6 底物显色液：邻苯二胺(OPD
与过氧化氢混合溶液，配制方法见 I.8。

4.9.2.7 终止液：0.5 mol/L 柠檬酸溶液，配制方法见
I.9。

4.9.3 操作方法(以检测牛血清为例)

4.9.3.1 取包被酶标板，在1列～10列每孔加入20 μL
待检血清，在A11、A12、B11、B12、C11、C12 各 孔各加入20μL 阴性血清，在
F11、F12、G11、G12、H11、H12各孔各加入20 μL 阳性血清，在D11、D12、

E11、E12 各孔不加入稀释缓冲液，留作酶标结合物对照(见图2)。

说明：

C— 酶标结合物对照孔；

T— 待检血清孔；

style="width:4.66042in;height:3.18681in" />

+—阳性对照孔；

——阴性对照孔。

图 2 酶标板微孔排列示意

4.9.3.2
酶标板每孔加入稀释至工作浓度的酶标单克隆抗体100μL。

4.9.3.3 将酶标板放到微量振荡器上振摇2 min,
加盖在旋转振荡器(160次/min) 室温孵育30 min。
当没有旋转振荡器时，则需要手动振摇。先振摇30 s,之后每10 min 振摇10
s,时间共持续1 h。 手 动 振摇不应使孔内液体溢出。

4.9.3.4
甩出微孔中的液体，用洗涤液润洗5次，在吸水纸巾上反复拍打酶标板，确保酶标板各孔内无
残留液体。

GB/T 18646—2018

4.9.3.5 每孔加入100μL 现配的底物显色液(混合液配制见
I.6),室温孵育10 min～15 min。

4.9.3.6 每孔加入100 μL
终止液。用吸水纸巾吸去酶标板底部的水珠，在酶标仪450 nm 测定吸光度 (OD)
值。

4.9.4 结果判定

4.9.4.1 实验成立的条件：

a) 6 个阴性对照孔的平均 OD 值应>0.700,6个阳性对照孔的平均 OD
值应\<0. 100,4个酶标结

合物对照孔的 OD 值应>0.700。

b) 结合率应>10,结合率计算按式(2)。

style="width:4.76012in;height:0.6534in" /> (2)

4.9.4.2 判定：4个酶标结合物对照孔的平均 OD
值×60%定为阴阳性的临界值。待检血清的OD 值 ≤

临界值判为阳性，待检血清的 OD 值>临界值判为阴性。

警示——
以下的病原学操作包括涂片染色镜检、分离培养、细菌鉴定、布鲁氏菌Bruce-Ladder
检 测 方法中涉及细菌活菌操作等应在满足 GB 19489—2008 的 BSL-3
级生物安全实验室内进行，检测人员

应采取针对性防护措施。

4.10 涂片染色镜检

将组织或生物液体进行涂片，加热或酒精固定后，用改良萋-尼氏(Ziehl-Neelsen)
方法染色后
镜检，布鲁氏菌菌体染成红色球杆菌或短棒状杆菌，背景为蓝色。革兰氏染色呈阴性，
一般不发生

两极着染。

4.11 分离培养

4.11.1 细菌分离

对于采集的动物组织及疑似感染病料按以下方法处理并接种于培养基，样品采集符合GB/T
18088

出入境动物检疫采样。

组织样品：对无菌采集的组织，剔除多余部分(如脂肪)剔除后，取5 g
组织剪成小块，加入10 mL 无

菌 PBS 缓冲液进行研磨后，取200μL 接种于选择培养基表面，培养基见附录J。

阴道冲洗液、精液、关节液、胃内容物等，取200 μL
接种于选择培养基表面，培养基见附录J。

取 1 5mL 乳样，2000 g 离心15 min, 用 1 0 μL
接种环取奶油层2环，接种于选择培养基表面。培

养基见附录J。

每份样品均一式两份，分别置于普通培养箱和5%～10% CO₂ 培养箱中，37℃培养3
d～10d。

4.11.2 菌落观察

形态观察：布鲁氏菌菌落呈圆形，直径1 mm～2mm,
边缘光滑。透射光下，菌落呈浅黄色有光泽，

半透明。从上面看，菌落微隆起，灰白色。随时间推移，菌落变大，颜色变暗。

染色观察：用移液器吸取结晶紫稀释染液(配制方法见附录 K), 浸没菌落15
s～20 s,然后吸取染

色液弃置到消毒液中。光滑型菌落不着色，变异菌落被染成紫色或红色。

GB/T 18646—2018

4.12 细菌鉴定

4.12.1 对 CO₂ 需求试验

培养物分离后立即测定，用菌悬液接种4支含血清琼脂斜面，2支置于普通培养箱，2支置于5%~

10%CO₂ 培养箱，37℃培养2 d～3d, 观察比较4支斜面生长情况。

4.12.2 H₂S 试验

将 H₂S
试纸条放入接种培养物的斜面培养基管内，夹在管壁和塞子之间，且不和培养基接触。置

于37℃培养箱培养，若有 H₂S
产生，则试纸条顶端变黑。每天记录结果并更换试纸条，持续4 d。

4.12.3 氧化酶试验

新鲜配制氧化酶试剂，配制方法见附录 L,
取约载玻片大小的滤纸条在该试剂中浸渍后置于平皿中
备用。用接种环蘸取一环新鲜培养物，涂压在准备好的滤纸条上，10 s
后观察颜色变化。氧化酶阳性可

使涂压培养物处变为黑色。

4.12.4 脲酶试验

用接种环蘸取一环新鲜培养物，涂压在含2%尿素的培养基上，培养基配制方法见附录
M, 观察颜

色变化。室温保存该培养基，24 h,约 5 h
观察一次。分解脲的菌株可使培养基由黄色变为粉红色。

4.12.5 对硫堇、复红染料的敏感性试验

用无菌棉拭子浸蘸菌悬液，在分别含硫堇、复红染料的培养基(染料浓度为20μg/mL)
上划一横 线，置于37℃培养箱培养，3 d～4d
后观察平皿菌落生长情况。每个平皿上的不同菌悬液横线不得交

叉、接触。

4.12.6 特异性血清凝集反应试验

光滑型菌应用布鲁氏菌 A 和 M
表面抗原特异单价血清进行凝集反应试验，粗糙型菌应用布鲁氏 菌 R
抗原的单价血清进行凝集反应试验。出现明显的凝集反应可确定菌株为相应种、型的布鲁氏菌

(表4)。

表4 布鲁氏菌生化反应及单因子血清试验

GB/T 18646—2018

表4(续)

4.12.7 噬菌体溶解试验

应用本方法可将布鲁氏菌鉴别到种(表5)。

以无菌生理盐水将待检菌株制成10亿/mL
悬液，然后涂布于干燥的琼脂平皿上，稍干后，用直径 为 2 mm
的铂金耳环勾取标准噬菌体液加于平皿上，置37℃恒温箱中经24 h
初步观察结果，再放置室

温下，经24 h 后判定最后结果。

结果判定依据：细菌完全不生长，判为+(阳性);部分生长，判为±(可疑);细菌生长良好，判为一

(阴性)。

表 5 噬菌体对不同种布鲁氏菌的溶解

GB/T 18646—2018

4.13 布鲁氏菌 Bruce-Ladder检测方法

4.13.1 布鲁氏菌 DNA 的制备

从平板上选择单个菌落，用灭菌接种环取一环菌，接种到200 μL
生理盐水中，煮沸30 min,12000 g 离心30 s,取 1 μL 上清液作为DNA
模板用于PCR 扩增(约0.1μg/μL),或使用商品化的DNA 提取试

剂盒提取 DNA 作为模板，DNA 模板可置于-20 ℃保存备用。

4.13.2 PCR 反应体系

PCR 反应体系见表6。

表 6 PCR 反应体系(总体积为25μL)

PCR
反应管中依次加入上述成分，充分混匀后，瞬时离心，确保所有反应成分混匀并集于管底。

4.13.3 PCR 对照

同时设阴性对照、阳性对照，阳性对照为标准菌株 DNA, 阴性对照为不含 DNA
的反应体系。

4.13.4 扩增程序

将上述加有DNA 模板的 PCR 管，置于 PCR 仪内进行反应。反应条件如下：95℃7
min 预变性； 然后进行25个循环的扩增(95℃变性35 s,64℃ 退火45 s,72℃ 延 伸 3
min), 最后72℃延伸6 min,

4 ℃保存。

4.13.5 电泳

用 1 倍 TBE 缓冲液，参见附录 N, 配制1.5%琼脂糖凝胶平板，同时，加入0.005%
GoldView 核酸 染料，取 PCR 产 物 7 μL
与适量6倍溴酚蓝缓冲液混合，加样，7μL/孔，同时，设定1 kb plus DNA

ladder标准分子量标准，120 V 稳压电泳1 h,紫外灯下观察条带。

4.13.6 结果判定

4.13.6.1 试验成立的条件

当阴性对照不出现条带、阳性对照出现条带，试验成立时，参照图3进行判定。

4.13.6.2 判定

4.13.6.2.1 牛种布鲁氏菌：电泳同时出现152 bp 、450 bp 、587 bp 、774
bp 和1682 bp 共5条带。

GB/T 18646—2018

4.13.6.2.2 羊种布鲁氏菌：电泳同时出现152 bp、450 bp、587 bp、774
bp、1071 bp 和1682 bp 共 6 条带。

4.13.6.2.3 绵羊附睾种布鲁氏菌：电泳同时出现152 bp、450 bp、587 bp、774
bp和1071 bp 共5条带。 4.13.6.2.4 猪布鲁氏菌：电泳同时出现152 bp、272
bp、450 bp、587 bp、774 bp、1071 bp和1682 bp 共

7条带。

4.13.6.2.5 S19 疫苗菌株：电泳同时出现152 bp、450 bp、774 bp 和1682 bp
共4条带。

4.13.6.2.6 RB51 疫苗菌株：电泳同时出现152 bp、450 bp、587 bp、774 bp
和2524 bp 共5条带。

4.13.6.2.7 Rev1 疫苗菌株：电泳同时出现152 bp、218 bp、450 bp、587
bp、774 bp、1071 bp和1682 bp 共7条带。

4.13.6.2.8 犬种布鲁氏菌：电泳同时出现152 bp 、272 bp 、450 bp 、587
bp 、1071 bp 和1682 bp 共

6条带。

4.13.6.2.9 沙林鼠种布鲁氏菌：电泳同时出现272 bp 、450 bp 、587 bp
、774 bp 、1071 bp 和1682 bp 共

6条带。

4.13.6.2.10
海洋种布鲁氏菌(鳍型布鲁氏菌、鲸型布鲁氏菌):电泳同时出现152 bp 、587 bp
、774 bp、

1071 bp、1320 bp 和1682 bp 共6条带。

4.13.6.2.11 田鼠种布鲁氏菌：电泳同时出现152 bp 、272 bp 、450 bp
、510 bp 、587 bp 、774 bp 、1071 bp 和1682 bp 共8条带。

4.13.6.2.12 B.inopinata 布鲁氏菌：电泳同时出现152 bp 、272 bp 、450
bp 、587 bp 、774 bp 和1682 bp

共6条带。

style="width:9.15318in;height:3.57346in" />

图 3 布鲁氏菌种 PCR 扩增图谱

GB/T 18646—2018

附 录 A

(规范性附录)

试管凝集试验参照比浊管的制备

每次试验需配比浊管，作为判定凝集反应程度的依据，先将已经稀释好的工作抗原用等量稀释液作

对倍稀释，然后按表 A.1 配制比浊管。

表 A.1 参照比浊管的配制

GB/T 18646—2018

附 录 B

(规范性附录)

补体结合试验试剂配制及受检血清的采集和处理

B.1 巴比妥缓冲液(pH7.2)

取巴比妥0.575 g, 巴比妥钠0.185 g,氯化钠8.500 g,六水氯化镁0.168
g,无水氯化钙0.028 g,加蒸

馏水使溶解并稀释至1000 mL, 用 2 mol/L 盐酸溶液调节 pH
值至7.2,过滤即得。

B.2 血清稀释

以常规方法采血和分离血清。微量补体结合试验用巴比妥缓冲液(B.1)
将血清作1:4稀释(25 μL 血清加入75 μL
稀释液);常量补体结合试验用稀释液(4.7.2.2.1)将血清作1:10稀释，按表B.1
规定的

水浴灭能。

表 B.1 各种被检动物血清的灭能温度和时间

GB/T 18646—2018

附 录 C

(规范性附录)

溶血素的效价测定

C.1 稀释溶血素

取0.2 mL 含等量甘油防腐的溶血素，加9.8 mL
稀释液配成100倍稀释的基础稀释液，按表C.1 方

法作进一步稀释。

表 C.1 溶血素稀释法 单位为微升

C.2 按 表C.2 加入各成分，而后37℃~38℃水浴20 min。

表 C.2 微量法溶血素效价测定表

单位为微升

孔	1 (溶血素对照)		2	3	4	5	6	7	8	9
溶血素稀释倍数	250		250	500	1000	2000	3000	4000	5000	6000
稀释的溶血素	25		25	25	25	25	25	25	25	25
2.5%红细胞	25		25	25	25	25	25	25	25	25
稀释液	75		50	50	50	50	50	50	50	50
10倍稀释补体			25	25	25	25	25	25	25	25
轻轻震动平板混匀，而后37℃水浴30 min
		300 g～600g冷冻离心5 min～10 min

溶血素对照应完全不溶血。

表 C.3 常量法溶血素效价测定表

GB/T

18646—2018

单位为微升

C.3 溶血素效价

从水浴中取出，立即判定结果，能使2.5%红细胞液25μL (微量法)或500μL
(常量法)完全溶血的 最小量溶血素为溶血素效价或称一单位溶血素。以表C.3
为例，对照管均不溶血，1管～6管完全溶血，

测定溶血素效价为3000倍稀释。

在主试验时溶血素的工作效价为滴定效价的倍量或称二单位溶血素，则工作效价为1500倍稀释。

效价测定后，2～3个月内可按此效价使用，不必重测。

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附 录 D

(规范性附录)

补 体 制 备

D.1 补体采集

选择健康豚鼠3只～5只，于使用前一天早晨喂饲前或停食后6 h
从心脏采血，分离血清后混合保

存于普通冰箱中，也可从兽医生物药品厂购买冻干补体，使用前加稀释液恢复原量后使用。

每次补体结合试验，应于当日测定补体效价。

D.2 补体效价测定

D.2.1 微量法补体效价测定

D.2.1.1 稀释补体并加各种成分

应于补体结合试验当日测定补体效价。按商品使用说明书提供稀释度稀释(以1:100为例)。用
稀释液配制1:100稀释补体(如果测定过程中发现补体含量低，可做其他稀释度选择),按表
D.1 加 入

各种成分后，前后经37℃ 30 min 水 浴 2 次 。

D.2.1.2 效价测定

经过2次水浴，在二单位溶血素存在情况下，阳性血清加抗原的试管完全不溶血，而在阳性血清未
加抗原及阴性血清无论有无抗原的试管发生完全溶血所需要最小补体量，就是所测得的补体效价。以

表 D.1 为例，第7管1:100稀释的补体100μL 即为一个补体单位。

表 D.1 微量补体结合试验补体效价测定 单位为微升

一单位补体工作效价：将完全溶血及完全抑制各取500 μL
至试管中，制备成50%溶血补体稀释
度；对照准备对比各个补体稀释度，取颜色与50%溶血补体相近稀释度的补体量为一单位补体工作

效价。

GB/T 18646—2018

原补体使用时应稀释倍数的计算：对比颜色时以自然光或白色为背景对比。以上表为例，第7管
1:100 稀释的补体100 μL
即为一单位补体工作效价。以一个微孔反应板为例，根据以下式计算出所

需补体用量：100/200×1/100×6×25×100=75μL。

D.2.2 常量法补体效价测定

D.2.2.1 稀释补体并加各种成分

应于补体结合试验当日测定补体效价。用稀释液配制1:20稀释(如果测定过程中发现补体含量
低，可做1:10稀释或其他稀释度选择)补体，按表 D.2
加入各种成分后，前后经37℃~38℃ 20 min

水浴2次。

D.2.2.2 效价测定

经过2次水浴，在2单位溶血素存在情况下，阳性血清加抗原的试管完全不溶血，而在阳性血清未
加抗原及阴性血清无论有无抗原的试管发生完全溶血所需要最小补体量，就是所测得的补体效价。以

表 D.2 为例，第6管1:20稀释的补体250μL 即为一个补体单位。

表 D.2 补体效价测定

单位为微升

GB/T 18646—2018

D.2.2.3 原补体使用时应稀释倍数的计算

原补体使用时应稀释倍数按式(D.1) 计算：

style="width:6.57999in;height:0.6468in" /> … … … … … …(D. 1)

式中"补体稀释倍数"为补体效价测定试验补体的实际稀释度，"测得效价"为稀释后的补体加入量，

"使用时每管加入量"为主试验时每管需加的含一个工作单位补体的液体量。

以表 D. 1
为例，按式(1)计算style="width:2.06097in;height:0.57992in" />

即此例补体应作40倍稀释，每管加500μL,
即为一个补体单位。考虑补体性质不稳定，操作过程
中效价会降低，正式试验时使用浓度比补体效价要大10%左右，本例补体工作单位应作36倍稀释，每

管使用500 μL。

GB/T 18646—2018

附 录 E

(规范性附录)

标准比色管/孔

E.1 微量补体结合试验溶血标准比色孔的制备

制备时以完全溶血的对照(抗原对照或补体对照)和完全抑制溶血的对照(致敏红细胞对照)各取

50μL 做50%溶血对照，见表 E.1。

表 E.1 微量法溶血标准比色孔的制备 单位为微升

E.2 常量补体结合试验溶血标准比色管的制备

配制方法如表E.2,牛、羊和猪补体结合反应判定标准均相同。

表 E.2 常量法溶血标准比色管的制备

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附 录 F

(规范性附录)

抗原效价测定

一般按照兽医制药厂产品说明书的效价使用。在初次使用或过久等其他原因需要测定时按下述步

骤进行。

F.1 测定抗原效价

取用两份阳性血清(分别为强阳性和弱阳性血清)和一份阴性血清来测定抗原效价。

F.2 阴性血清和阳性血清稀释

用稀释液对阴性对照血清仅作1:10稀释，阳性血清稀释成1:10、1:25、1:50、1:75和1:100,

5个稀释度。

F.3 稀释抗原

用稀释液将抗原稀释成1:10、1:50、1:75、1:100、1:200、1:300、1:400和1:500等稀释度。

F.4 加样

按表 F.1 加入各种成分，并经37℃~38℃ 20 min 水浴2次。

表 F.1 布鲁氏菌补体结合抗原效价测定

单位为微升

F.5 记录抗原测定结果

从水浴中取出反应管，观察溶血百分数，记录结果。

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例举范例如表 F.2。

表 F.2 布鲁氏菌补体结合抗原效价滴定结果(举例)

F.6 抗原效价

抗原对阴性血清应完全溶血。对两份阳性血清各稀释度发生抑制溶血最强的抗原最高稀释度为抗

原效价。

在正式试验时，抗原的稀释度应比测定的效价浓25%。以表 F.2
为例，其效价为1:150,正式试验

时按1:112.5稀释使用。

GB/T 18646—2018

附 录 G

(规范性附录)

酶联免疫吸附试验抗原包被板的制作

G.1 试剂与材料

G.1.1 菌株：流产布鲁氏菌S1119-3 或 S99 菌株。

G.1.2 苯酚溶液：称取90 g 苯酚溶于10 mL 水中，混匀。

G.1.3 乙酸钠甲醇溶液：5 mL 饱和乙酸钠溶液中加入495 mL 甲醇，混匀。

G.1.4 三氯乙酸

G.1.5 96 微孔聚苯乙烯板

G.2 仪器

恒温水浴锅、转速可达到10000 g 的低温离心机(4℃±1℃)、冰箱。

G.3 制作步骤

G.3.1 抗原提取

警示 — —
以下操作应为在三级、四级生物安全实验室从事的高致病性病原微生物实验活动。遵从

《病原微生物实验室生物安全管理条例》第二十 一 条。

以牛种布鲁氏菌为例：

提取光滑型布鲁氏菌脂多糖(sLPS), 将牛种布鲁氏菌 S1119-3 或 S99
株(G.1.1) 干 重 5 g 或湿重 50g 菌细胞溶于170 mL
蒸馏水中，加热到66℃,然后加入66℃ 190 mL 苯酚溶液(G.1.2), 在此温度
下持续搅拌15 min, 冷却后在4℃条件下以10000 g 离心15 min。
静止分层后吸弃下层棕红色的酚

相，过滤(用Whatman 1号滤器)以去除大块菌体碎片。

加入500 mL 饱和乙酸钠甲醇溶液(G.1.3)沉淀脂多糖。4℃孵育2 h,10000g
离心10 min, 分 离 沉淀物。沉淀用80 mL 蒸馏水搅拌18 h,10000g 离心10
min。 上清液于4℃保存。沉淀再悬浮于

80mL 灭菌蒸馏水，于4℃再搅拌2 h。
依上法离心获上清液，并与前述上清液混合。

随后，在160 mL 粗制脂多糖中加入8 g 三氯乙酸(G.1.4)。 搅拌10 min
后，离心除去沉淀，上清液

以蒸馏水透析(换2次，每一次至少4000 mL), 然后冻干。

对冻干的脂多糖称重，以1 mg/mL
的含量悬浮于抗原包被缓冲液(I.1)中，然后于冰浴中用大约

6瓦超声裂解3次，每次1 min。 然后以1 mL 量分装冻干，室温保存。

G.3.2 抗原的包被

冻干的脂多糖(G.3.1)重新溶解到1 mL
蒸馏水中，再用抗原包被缓冲液(I.1)稀释到0.5 μg/mL。
用稀释后的脂多糖溶液包被96孔聚苯乙烯板(G.1.5),每孔加100μL,
加盖于4℃温孵18 h～24 h。 孵 育后，用 PBST1(I.2)
洗涤微量板4次以去除未吸附的抗原。平板可直接使用，也可封起来，于—20℃

冻存一年以上。用前于37℃ 30 min～45 min解冻。

GB/T 18646—2018

附 录 H

(规范性附录)

酶标抗体的制备

H.1 酶标单克隆抗体的制备

用预定抗原免疫小鼠，通过杂交瘤技术获取分泌特异性单抗的杂交瘤细胞系，将此杂交瘤细胞免疫

Balb/C 小鼠，抽取小鼠腹水制备单克隆抗体(BM40)。

用此单克隆抗体与辣根过氧化物酶(HRP) 偶联后，0.2μm
滤膜过滤，储存于2℃~8℃。使用时

用酶标抗体稀释缓冲液(I.2)进行100倍稀释。

H.2 酶标多克隆抗体的制备

分离纯化青年牛(或羊)血清中 IgG, 以牛(或羊)IgG
免疫新西兰兔，获得兔抗牛(或羊)IgG 的血
清，分离纯化，制备兔抗牛(或羊)IgG。 将兔抗牛(或羊)IgG
和辣根过氧化物酶(HRP) 偶联后，0.2μm

滤膜过滤，储存于2℃~8℃。使用时用酶标抗体稀释缓冲液(I.2)进行100倍稀释。

GB/T 18646—2018

附 录 I

(规范性附录)

酶联免疫吸附试验用试剂配制

I.1 抗原包被缓冲液(0.05 mol/L 的 pH 9.6
碳酸盐缓冲液)

称取2.93 g 碳酸氢钠，1.59 g 碳酸钠，0.2 g 叠氮钠溶于1000 mL
蒸馏水中，混匀。121℃,30 min

高压灭菌，4℃冰箱保存备用，保存不超过1个月。

1.2 稀释缓冲液(0.01 mol/L 的 pH7.2
磷酸盐缓冲体系 PBST1)

称取1.4 g 磷酸氢二钠、0.20 g 磷酸二氢钾、8.50 g 氯化钠，量取0.5 mL
吐温-20溶于1000 mL 蒸 馏水中，混匀。调节pH 值至7.2,121℃高压灭菌30
min,待其冷却后加入0.5 mL 吐温-20,混匀，4℃

冰箱保存备用，保存不超过1个月。

I.3 洗涤缓冲液(0.01 mol/L 的 pH7.2
磷酸盐缓冲体系 PBST2)

称取1.4 g 磷酸氢二钠溶于1000 mL 蒸馏水中，混匀。调节pH
值至7.2,121℃高压灭菌30 min,

待其冷却后加入0.1 mL 吐温-20,混匀，4℃冰箱保存备用，保存不超过1个月。

I.4 底物溶液(3%过氧化氢溶液)

量取50mL30% 过氧化氢原液溶于450 mL
蒸馏水中，混匀，避光保存，现配现用。

I.5 底物缓冲液(pH4.4 柠檬酸缓冲液)

称取7.6 g 二水柠檬酸三钠、4.6g 柠檬酸溶于1000 mL
蒸馏水中，混匀。调节pH 值至4.5,121℃

高压灭菌30 min。 冷却后4℃冰箱保存备用，保存不超过1个月。

I.6 显色液[0.16 mol/L
ABTS(2,2-二氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸))溶液]

称取87.79 g ABTS溶于1000 mL 蒸馏水中，混匀即为0.16 mol/L 的 ABTS。121
℃高压灭菌

30 min,冷却后4℃冰箱保存备用，保存不超过1个月。

使用时，将100 μL 的3%过氧化氢、500 μL 的0.16 mol/L ABTS加入20 mL
底物缓冲液中，即得

底物显色混合液(含1.0 mmol/L 过氧化氢、4 mmol/L ABTS)。

I.7 终止液(0.5 mol/L 叠氮化钠)

称取32.5 g 叠氮化钠溶于1000 mL
蒸馏水中，混匀，4℃冰箱保存备用，保存不超过1个月。

GB/T 18646—2018

I.8 底物显色液[邻苯二胺(OPD) 与过氧化氢混合溶液]

称取30 mg 邻苯二胺溶于75 mL 蒸馏水中，加入30%过氧化氢0.3 mL,
混匀，现配现用。

1.9 终止液(0.5 mol/L 柠檬酸溶液)

称取96.07 g 柠檬酸溶于1000 mL
蒸馏水中，混匀，4℃冰箱保存备用，保存不超过1个月。

GB/T 18646—2018

附 录 J

(规范性附录)

布鲁氏菌培养基制作及病料采集

J.1 培养基

J.1.1 基础培养基配方

琼脂

蛋白胨

氯化钠

肉膏

加水

15 g～20 g

10 g

5 g

5 g

1000 mL

上述成分混合，加热使琼脂溶化，然后调 pH
至7.8,再将培养基分装三角瓶中，然后置20 磅 (1磅～0.00689 MPa)
高压灭菌，顷刻间可析出大量盐类结晶，趁热过滤，再调 pH 至7.4,10磅高压

15 min。冷却后置4℃冰箱备用。

J.1.2 血清葡萄糖培养基

将基础培养基(J.1.1)融化，冷却至50℃,于其中加入除菌并灭活的正常马或小牛血清以及除菌和

葡萄糖溶液，使血清的终浓度为5%,葡萄糖的终浓度为1%。

该培养基用于布鲁氏菌的纯培养。

J.1.3 选择培养基

在1000 mL

多黏菌素

杆菌肽

游霉素

萘啶酸

制霉菌素

万古霉素

血清葡萄糖培养基中加入下列成分，即为选择培养基。

5 mg

25 mg

50 mg

5 mg

17.7 mg

20 mg

若培养羊种布鲁氏菌，需1000 mL 血清葡萄糖培养基中加入下列成分：

多黏安乃近

万古霉素

呋喃妥因

制霉菌素

两性霉素 B

7.5 mg

3 mg

10 mg

17.7 mg

2.5 mg

选择培养基用于陈旧性病料和污染性病料的培养。

GB/T 18646—2018

J.2 病料采集

警示——对本病剖检采样过程当中应当防止病原微生物扩散和人员感染。

对于出现布鲁氏菌病临床症状的动物，采集的样品包括流产的胎儿(胃内容物、脾、肺)、胎衣、阴道
分泌物(阴道冲洗物)、奶、精液和关节液。死后采集样品的首选组织为网状内皮组织(乳头、乳腺、生殖

器淋巴结、脾)、妊娠后期或生产后早期的子宫、乳腺。

GB/T 18646—2018

附 录 K

(规范性附录)

结晶紫储备液配制方法

K.1 A 液：称取2 g 结晶紫染料溶于20 mL 无水乙醇中。

K.2 B 液：秤取0.8 g 草酸铵溶于80 mL 蒸馏水中。

K.3 A 液 和B
液充分混合后即为储备液。储备液应在密封瓶中保存，可使用3个月。

K.4 使用时用蒸馏水按1:40稀释为工作液即可。

GB/T 18646—2018

附 录 L

(规范性附录)

氧化酶试验试剂配制方法

警 示 — —N,N- 二甲基-
1,4-苯二胺草酸盐具有毒性，有害健康 。

L.1 取 1 mL 蒸馏水于带密封盖离心管中。

L.2 加入N,N- 二甲基-1,4-苯二胺草酸盐约10 g。

L.3 盖好密封盖，震荡混匀，配制成氧化酶试剂。

L.4 实验时现用现配。

GB/T 18646—2018

附 录 M

(规范性附录)

尿素酶活性试验培养基配方及制备方法

M.1 培养基配方

蛋白胨

氯化钠

磷酸氢二钾

葡萄糖

酚红

琼脂

尿素

蒸馏水

1g

5 g

2 g

1 g

0.012 g

10 g

20 g

1000 mL

M.2 制备方法

除葡萄糖、酚红和尿素外，其余各成分按比例混合加热溶解过滤，调 pH
为6.9,加葡萄糖和酚红，高

压灭菌20 min
取出，冷却至55℃,无菌加入尿素充分混匀，制备成平板或斜面培养基。

GB/T 18646—2018

附 录 N

(规范性附录)

PCR 引物序列及电泳缓冲液

N.1 PCR 引物序列

TATAA-3'

N.1.3 上游引物：5'-TTTACACAGGCAATCCAGCA-3';
下游引物：5'-GCGTCCAGTTGTTGTT-

GATG-3'

N.1.4 上游引物：5' -TCGTCGGTGGACTGGATGAC-3'; 下游引物：5'
-ATGGTCCGCAAGGT-

GCTTTT-3'

N.1.5

TCG-3'

N.1.6

上游引物：5'-GCCGCTATTATGTGGACTGG-3';

上游引物：5'-GGAACACTACGCCACCTTGT-3';

下游引物：5'-AATGACTTCACGGTCGT-

下游引物：5'-GATGGAGCAAACGCT-

GAAG-3'

TACCT-3'

N.2 10 倍 TBE 缓冲液

N.2.1 组分

89 mmol/L Tris-硼酸，2.0 mmol/L EDTA,pH 8.0。

N.2.2 配制

称取 Tris 108 g,Na₂EDTA ·2H₂O7.44 g,硼 酸 5 5 g, 置 于 1 L
烧杯中，向烧杯中加入约800 mL

蒸馏水，充分搅拌溶解，调pH 至8.0,加蒸馏水定容至1 L,室温保存。

延伸阅读

更多内容 可以 GB-T 18646-2018 动物布鲁氏菌病诊断技术. 进一步学习

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