ICS 65.020.20 B 05 DB 15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB 15/T 1938—2020 沙地云杉组织培养技术规程 Technical Regulation for Tissue Culture of Picea mongolica 2020-07-30 发布 内蒙古自治区市场监督管理局 2020-08-30 实施 发 布 DB 15/T 1938—2020 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2020给出的规则起草。 本标准由内蒙古自治区林业和草原局提出并归口。 本标准起草单位：内蒙古农业大学、内蒙古蒙荣园林绿化工程有限责任公司。 本标准主要起草人：白玉娥、韩彦龙、哈布尔、代金玲、包文泉、彭鹏、娜苏勒玛、苗慧琴。 I DB 15/T 1938—2020 沙地云杉组织培养技术规程 1 范围 本标准规定了沙地云杉组织培养育苗的术语和定义、环境器具消毒灭菌、培养基、外植体、胚性愈 伤组织诱导、胚性愈伤增殖培养、体细胞胚胎分化培养、体胚干化萌发培养、炼苗、移植培养等基本内 容及技术要求。 本标准适用于利用沙地云杉组织培养技术生产苗木。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 LY/T 1882 林木组织培养育苗技术规程。 DB15/T 1588 元宝枫组织培养育苗技术规程。 3 术语和定义 LY/T 1882和DB15/T 1588界定的术语和定义适用于本文件。 4 环境器具消毒灭菌 4.1 洗涤室和接种室消毒 工作前和结束后，使用臭氧紫外灯照射1 h。 4.2 培养室消毒灭菌 每天工作结束后使用臭氧紫外灯照射消毒2 h。如有较严重的组培苗感染现象，应采用甲醛(HCHO， 10 mL/m³)和高锰酸钾(KMnO4，5 g/m³)混合薰蒸消毒，在密闭条件下熏蒸消毒20 min～30 min，消毒后 要打开门窗通风换气。 4.3 超净工作台消毒灭菌 接种前用臭氧紫外灯照射消毒不少于30 min，并用70 %酒精喷洒消毒台面；定期清洗超净工作台的 过滤膜。 4.4 器具灭菌 4.4.1 接种器具灭菌 在一个接种台班结束后，使用器具流水冲洗后，用锡箔纸包好，置于高压灭菌锅灭菌。接种工具使 用前，用酒精灯外焰灼烧20s以上，或用接种工具灭菌器直接灭菌。 1 DB 15/T 1938—2020 4.4.2 培养容器消毒灭菌 使用后的培养容器，流水冲洗残留培养基，高压灭菌锅消毒后存放。 5 培养基 5.1 基本培养基 胚性愈伤诱导、增殖和分化均采用1/2 LM基本培养基，干化萌发培养采用1/2 MS基本培养基。 5.2 母液和激素配制与保存 5.2.1 母液和激素配制 培养基母液配制见附录A.1、A.2。激素均配制浓度为1.0 mg/mL。 5.2.2 母液和激素保存 母液和激素配制后，贴标签，记录溶液名称、配置时间、配置者，并在4 ℃条件下保存。母液应于 3个月之内使用，母液无结晶、无异色才能使用。 5.3 基本培养基配制 5.3.1 琼脂融化 以配置1 L培养基为例（下同），加蒸馏水700 mL左右，再加入5.5 g～6 g琼脂，加热搅拌使琼脂 融化。 5.3.2 糖溶解 琼脂融化后，加入20 g蔗糖，搅拌使糖溶解。 5.3.3 加母液 糖溶解后，按照附录A.1或附录A.2的要求加入母液，搅拌均匀。 5.3.4 培养基定容 搅拌均匀后，加蒸馏水定容至1 L。 5.3.5 基本培养基 pH 值调节 充分搅拌后，将基本培养基pH值调节至5.7～5.8。 5.3.6 基本培养基分装 使用240 mL规格的培养瓶定量分装，胚性愈伤诱导、增殖、分化培养均每瓶分装50 mL；干化萌发 培养使用350 mL规格的培养瓶，每瓶分装65 mL，分装时勿将培养基沾在培养瓶瓶口。 5.3.7 培养瓶封口 盖紧瓶盖，或用封口膜封口。 5.3.8 培养基灭菌 2 DB 15/T 1938—2020 2 用高温高压蒸汽灭菌锅进行灭菌，蒸气压力102.9 kPa（1.05 kg/cm ），温度121 ℃条件下保持15 min～20 min即可。 5.3.9 培养基冷却 灭菌后的培养基放在无菌环境中冷却，待完全凝固后使用。 5.3.10 培养基贮存 灭菌后的培养基应标明编号、种类、配制日期，在4 ℃无菌条件下贮藏备用，贮存时间不应超过1 个月。 6 外植体 6.1 球果采集与清洗 8月初，采集授粉第10周的未成熟球果，清洗表面。 6.2 种子剥离与灭菌 球果中剥取未成熟种子置于清水中，取下沉的种子置于培养皿中，用75 %酒精浸泡30 s～40 s，无 菌水冲洗3次，再以2 %次氯酸钠浸泡灭菌6 min，无菌水冲洗3～5次，用灭菌滤纸吸附残留水分。 6.3 外植体制备 在超净工作台上，从灭菌的未成熟种子剥取完整合子胚作为外植体备用。 7 胚性愈伤组织诱导 7.1 培养基 胚性愈伤组织诱导培养基为1/2 LM + 6-BA 1.2 mg/L + 2,4-D2.7 mg/L。 7.2 接种 将外植体均匀接种于培养基上，每瓶可接种10个，接种后将瓶口迅速于酒精灯火焰上灼烧2 s，拧 紧瓶盖，标明编号。 7.3 培养 将接种后的培养瓶摆放培养架上，在温度25 ℃±1 ℃条件下，暗培养25 d～30 d。 8 胚性愈伤增殖培养 8.1 培养基 增殖培养基为1/2 LM + 2,4-D 0.8-1.6 mg/L + 6-BA0.8 mg/L。 8.2 接种 3 DB 15/T 1938—2020 在超净工作台上，将诱导产生的胚性愈伤组织接种于增殖培养基上，每瓶均匀接种5个，接种后盖 紧瓶盖，标明编号。 8.3 培养 将接种后的培养瓶摆放在组培架上。在温度25 ℃±1 ℃条件下，暗培养25 d～30 d。 9 体细胞胚胎分化培养 9.1 培养基 分化培养基为1/2 LM + ABA 22.5 mg/L + PEG-4000 45 g/L。 9.2 接种 从增殖培养基上取胚性愈伤组织，接种在分化培养基上，每瓶均匀接种5个。 9.3 培养 将接种后的培养瓶摆放在培养架上；在温度25 ℃±1 ℃条件下，暗培养45 d～50 d。 10 体胚干化萌发培养 10.1 干化 在超净工作台上，培养皿中垫两层湿润滤纸（以不滴水为宜），将分化成熟的体胚置于滤纸上，培 养皿封口摆放在培养架上，暗培养3 d后，在1500 Lx光照条件下培养7 d，至体胚子叶呈绿色、胚根呈 红色为止。 10.2 萌发 10.2.1 培养基 萌发培养基为1/2 MS + 30 g/L蔗糖+0.5 g/L酸水解酪蛋白 + 0.25 g/L谷氨酰胺 + 0.5 g/L活性炭 + 3 g/L琼脂。 10.2.2 接种 在超净工作台上，将干化后的体胚接种于萌发培养基上，每瓶接种5个。 10.2.3 培养 将接种后的培养瓶摆放在培养架上，在温度25 ℃±1 ℃、光照强度1500 Lx～2000 Lx、光照时间 为14 h/d条件下,光暗交替培养15 d。 11 炼苗 11.1 瓶苗炼苗 体胚萌发培养后，选择正常的组培瓶苗，置于温度25 ℃±2 ℃、湿度70 %～80 %、光照强度1500 Lx～ 2000 Lx的温室苗床上，松开瓶盖1 d～2 d，然后半开瓶盖1 d～2 d，最后揭去瓶盖3 d～5 d。 4 DB 15/T 1938—2020 11.2 穴盘炼苗 11.2.1 基质 草炭﹕蛭石﹕珍珠岩=3﹕2﹕1混合物作为基质。用多菌灵800倍液浸湿基质，用塑料布覆盖灭菌24 h 后使用。 11.2.2 穴盘 穴盘规格选用孔径8 cm、深度8 cm。灭菌后的基质填充穴盘容器，喷淋清水保湿，待用。 11.2.3 瓶苗移栽 取出瓶苗，用常温清水洗去残留培养基，避免损伤根部，穴盘基质扎孔植入瓶苗，穴盘置于温室苗 床上，常温清水饱和喷淋1次。温室使用前，用12 %百菌清烟雾剂熏蒸3～4次。 11.2.4 温湿度管理 移栽后，每天雾化喷水，保持环境湿度80 %～90 %、温度20 ℃～25 ℃。7 d后，逐渐降低湿度至 70 %～80 %，炼苗1个月。 11.2.5 病害防治 移栽后每隔 5 d～7 d喷施800倍液多菌灵或400倍～700倍代森锰锌或甲基托布津700倍～1500倍等 杀菌剂1次。 12 移植培养 12.1 移植 将穴盘中的幼苗连同基质一起移栽到相同基质的直径18 cm、深度20 cm的容器中，置于温室苗床继 续培养。 12.2 培养 12.2.1 水肥管理 移栽后，先在遮阴且通风良好的条件下，每天喷水1～2次，培养4 d～5 d，之后保持基质湿润，2 周后逐渐撤掉遮阴。每隔20 d叶面施肥1次。 12.2.2 病害预防 幼苗期，每隔7 d～10 d喷洒杀菌剂1次，连续喷洒3～4次。 5 DB 15/T 1938—2020 AA 附 录 A （规范性附录） 培养基母液配制 表A.1 LM 培养基母液配制 母液名称 大量元素 铁盐 微量元素 编号 A mg/L 扩大倍数 扩大后称量 1650 41250 KNO3 1900 47500 CaCl2·2H2O 440 MgSO4·7H2O 370 9250 KH2PO4 170 4250 FeSO4·7H2O 27.8 Na2EDTA·2H2O 37.3 MnSO4·4H2O 22.3 100 2230 ZnSO4·7H2O 8.6 100 860 H3BO3 6.2 100 620 KI 0.83 100 83 Na2MoO4·2H2O 0.25 100 25 CuSO4·5H2O 0.025 100 2.5 CoCl2·6H2O 0.025 100 2.5 甘氨酸 2 200 400 盐酸硫胺素 B1 0.1 200 20 盐酸吡哆酸 B6 0.5 200 100 烟酸 0.5 200 100 肌醇 100 50 5000 100 配置培养基吸取量 mL mL/L mg NH4NO3 25 母液定容体积 11000 2780 1000 40 1000 10 500 5 1000 5 500 10 B C D 有机成分 E 6 化试名称 3730 DB 15/T 1938—2020 附 录 A（续） （规范性附录） 培养基母液配制 表A.2 MS 培养基母液配制 母液名称 大量元素 铁盐 微量元素 编号 A 化试名