ICS 65.020.20 B 05 DB15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 1939—2020 文冠果组织培养育苗技术规程 Technical Regulation for Tissue Culture of Xanthoceras sorbifolia 2020-07-30 发布 内蒙古自治区市场监督管理局 2020-08-30 实施 发 布 DB15/T 1939—2020 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2020给出的规则起草。 本标准由内蒙古自治区林业和草原局提出并归口。 本标准起草单位：内蒙古自治区林业科学研究院。 本标准主要起草人：张文军、王美珍、黄卫丽、宁静。 I DB15/T 1939—2020 文冠果组织培养育苗技术规程 1 范围 本标准规定了文冠果组织培养的术语和定义、环境及器具灭菌、培养基配制、外植体及其灭菌、初 代培养、增殖继代培养、壮苗培养、生根培养、组培瓶苗炼苗移栽和大田培育等基本内容及技术要求。 本标准适用于文冠果组织培养育苗。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 LY/T 1882 林木组织培养育苗技术规程 DB15/T 1588 元宝枫组织培养育苗技术规程 3 术语和定义 LY/T 1882和DB15/ 1588界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 嫩茎 Tender stem 由腋芽经过初代诱导萌发长出的幼嫩枝条。 3.2 壮苗 Strong seedling 组培过程中，嫩茎经再培养后形成的生长健壮、叶片舒展、叶色正常的微弱木质化枝条。 4 环境及器具消毒灭菌 4.1 准备室消毒 每天用84消毒液等喷洒地面和实验台面，保持室内清洁。 4.2 接种室消毒灭菌 接种前用紫外灯照射30 min～40 min，消毒期间及关闭紫外灯20 min内，人员不得进入。 4.3 培养室消毒 一个月左右进行1次，在使用前一天用二氧化氯消毒剂进行熏蒸，或用70 %-75 %酒精擦拭培养架。 1 DB15/T 1939—2020 4.4 超净工作台灭菌 接种前应用紫外灯照射30 min-40 min，开启无菌风40min后，操作前用70 %-75 %酒精喷洒台面； 定期清洗超净工作台的过滤膜。 4.5 器具灭菌 4.5.1 接种工具灭菌 接种前，将接种工具用滤纸包好，置于高温高压灭菌锅灭菌；使用前用酒精灯外焰灼烧20 s以上， 或用接种工具灭菌器直接灭菌。 4.5.2 污染瓶（皿）灭菌、清洗 将污染瓶用高温高压蒸汽灭菌锅灭菌后，去除污染物，再用洗洁精稀释液浸泡后清洗干净，晾干。 4.6 操作人员入室要求 进入接种室前，经风淋门进入缓冲室，穿戴经过消毒的工作服、帽子、口罩等。在操作前，用70 %-75% 酒精擦拭手部、臂部。 5 培养基配制 5.1 基本培养基的选择 选择WPM和MS培养基为基本培养基。 5.2 母液的配制和保存 5.2.1 母液的配制 MS培养基由几种化合物的混合母液配制。微量元素母液配制1000倍，铁盐和有机元素母液配制100 倍，大量元素母液配制40倍，其中氯化钙和磷酸二氢钾单独配制成100倍母液，植物生长调节物质配制 浓度0.2 mg/mL。MS培养基混合母液配制表参见附录A，植物生长调节物质的配制参见附录B。 5.2.2 母液的保存 母液配制后，贴标签，置于4 ℃环境下保存，并在3个月内使用，母液应无结晶无异色。标签需标 明母液名称、倍数、配制时间和配制人等信息。 5.3 基本培养基的配制 5.3.1 准备 配制前准备好蒸馏水、蔗糖、琼脂和各类母液，同时准备好移液枪、容量瓶、量筒、量杯、天平、 药匙、磁力搅拌器和pH计等器具。 5.3.2 琼脂融化 以配制1L培养基为例（下同） 。加蒸馏水 700 mL左右，再加入5.8 g琼脂，加热搅拌使琼脂融化。 2 DB15/T 1939—2020 5.3.3 糖溶解 琼脂融化后，加入30 g蔗糖，搅拌使糖溶解。 5.3.4 加母液和激素 糖溶解后，加入母液，再根据不同培养基要求加入耐高温激素，充分搅拌。不耐高温的激素，如GA3、 IBA、IAA、ABA等应在培养基高温高压灭菌后加入，加入前需过滤灭菌。 5.3.5 定容 搅拌均匀后，加蒸馏水定容至 1 L。 5.3.6 pH 值测定和调节 充分搅拌后，用pH计测定pH值，用1 mol/L的HCl或1 mol/L 的 NaOH调节至pH 5.8～6.0。 5.3.7 分装 使用培养瓶定量分装，瓶中培养基厚度保持在1.5 cm～2.0 cm。分装培养基时勿将培养基沾在培养 瓶瓶口。分装后标注培养基种类代码。 5.3.8 封口 盖紧瓶盖，或用封口膜封口。 5.3.9 灭菌 应用高温高压蒸汽灭菌锅进行灭菌，通常在压力1.1 kg/cm2、温度121 ℃条件下保持20 min～30 min 即可。 5.3.10 冷却 灭菌后的培养基置于无菌接种室冷却，待完全凝固后使用。 5.3.11 贮存 灭菌后的培养基应标注配制日期。在无菌室温条件下贮存备用，贮存时间不应超过一个月。\ 6 外植体及其灭菌 6.1 外植体采集 6-8月份，晴天10点至16点之间，选取生长健壮、腋芽饱满、无病虫害的半木质化枝条。 6.2 外植体的灭菌 将采集的枝条剪掉叶片，置于容器内用洗洁精饱和液浸泡10 min，用软刷刷洗后，剪成长度8～10 cm 的枝段，放入容器内，用1层纱布等网状物包裹容器口，用流水冲洗 60 min～90 min后，置于超净工作 台上灭菌：用70 %酒精浸泡30 s，无菌水冲洗3次，再用0.1 %氯化汞溶液浸泡5 min，用无菌水冲洗5～ 8次，用灭菌滤纸吸附残留水分后接种。 3 DB15/T 1939—2020 6.3 外植体切段 在超净工作台内，用灭菌后的剪刀和镊子将枝段均匀切分成长度2 cm左右的外植体小段，每小段上 部至少保留1个腋芽。 7 初代培养 7.1 初代培养基 初代培养为WPM + 6-BA 1.0 mg/L +NAA 0.1mg/L+TDZ 0.05 mg/L+水解乳蛋白0.25 g/L+肌醇0.2 g/L。 7.2 外植体的接种 在超净工作台上，将外植体小段接种到初代培养基上，每瓶培养瓶接种1个外植体小段。小段下半 部斜插入培养基内，封紧瓶口，标明接种日期。 7.3 培养方法 将接种后的培养瓶送到培养室，整齐摆放在组培架上，诱导腋芽萌发，培养15 d-20 d。培养室温 度控制在25 ℃±2 ℃，相对湿度保持在40 ％～60 ％，光照强度控制在1500 lx～3000 lx，光照时间 13 h/d。 8 增殖继代培养 8.1 继代培养基 增值继代培养基为MS+6-BA 0.3 mg/L+IBA 0.8 mg/L+GA3 1.0 mg/L+AC 0.1 mg/L+Ca(NO3)2 1.0 g/L+ 琼脂6.0 g/L+蔗糖30.0 g/L。 8.2 培养方法 经初代培养，腋芽萌发的嫩茎生长到 3 cm～5 cm 时进行继代培养。 在超净工作台上，将初代培养的嫩茎切成2 cm左右且上部至少带有1个芽的茎段；每瓶培养基接种1 个茎段，将茎段下半段插入培养基内，封紧瓶口，标注转接日期。 将转接后的培养瓶送到培养室，整齐摆放在组培架上，20 d～30 d继代1次。培养条件同7.3。 9 壮苗培养 9.1 壮苗培养基 壮苗培养基为MS+6-BA 0.1 mg/L +IBA 0.3 mg/L+AC 0.1 mg/L。 9.2 培养方法 将继代增殖中生长瘦弱、长度不足2 cm的嫩茎整体转接到壮苗培养基中进行壮苗培养。培养20 d～ 30 d。培养条件同7.3。 4 DB15/T 1939—2020 10 生根培养 10.1 生根培养基 生根培养基为1/2MS + IBA 0.5 mg/L。 10.2 培养方法 当继代增殖培养或经过壮苗培养的嫩茎生长到2.0 cm～5.0 cm时，剪取壮苗接种在生根培养基上进 行生根培养，每个培养瓶接种1个壮苗。壮苗在培养基中的插入深度为5 mm～8mm，保持壮苗直立。培养 20 d～45 d可生根。培养条件同7.3。 11 组培瓶苗温室炼苗移栽 11.1 炼苗 当组培瓶苗达到2～3条长度1 cm以上白色嫩根、3～5片正常绿叶、苗高5 cm～6 cm时，将其置于温 度25 ℃±2 ℃、湿度80 %～90 %、光照强度1500 lx～2000 lx条件下的温室苗床上，锻炼3 d后，去掉 封口膜，再置于温室内小拱棚中，继续锻炼4 d。 11.2 移植 11.2.1 基质处理 采用体积比为松针土：珍珠岩：田园土为1:1:1混合物为基质。基质混合过程中均匀喷入多菌灵800 倍液。 11.2.2 移栽 用镊子取出组培瓶苗，在流动水下洗去残留培养基，避免损伤苗根；在口径9 cm、深12 cm的营养 钵内填装适量基质，将清洗后的组培瓶苗移栽到营养钵中，过程中避免伤根。移栽后置于小拱棚内。 11.2.3 移栽后管理 采用细喷雾喷水、遮阴网调节小拱棚内温湿度，保持湿度80 ％～90 ％、昼温21 ℃～29 ℃、夜温 18 ℃～21 ℃、基质湿润，1周后，逐渐降低湿度。 11.2.4 有害生物防治 移栽前对温室用百菌清烟雾剂熏蒸1次。移栽后每隔 7 d喷施1次多菌灵。 12 大田育苗 12.1 容器苗炼苗 生长季节，将容器苗从温室移至大田炼苗。将容器苗整齐紧密摆放在苗圃背风处，先用80 %透光率 的遮阴网遮盖炼苗1周，然后在自然条件下炼苗1周。 12.2 大田培育 5 DB15/T 1939—2020 12.2.1 整地 育苗地于前一年秋季深翻，并施入适量腐熟有机肥。 12.2.2 栽植 按株距30 cm～40cm、行距50 cm挖穴，移栽时去掉营养钵带土移栽，移栽后要及时灌溉，一周后浇 第二水灌溉。适时做好除草、松土、追肥、灌水等田间管理工作。 6 DB15/T 1939—2020 AA 附 录 A （资料性附录） MS 培养基混合母液配制 表A.1 MS 培养基混合母液配制表 母液名称 编号 mg/L 扩大倍数 母液定容体积 mg mL NH4NO3 1650 40 66000 KNO3 1900 40 76000 MgSO4·7H2O 370 40 14800 B CaCl2·2H2O 440 100 C KH2PO4 170 FeSO4·7H2O A 大量元素 铁盐 化试名称 扩大后称 D E 微量元素 F H 吸取量 mL/L 1000 25