ICS 11.220 B 41 DB37 山 东 省 地 方 标 准 DB37/T 3997—2020 细菌耐药基因 blaNDM 常见亚型的环介导等温 扩增检测技术 Loop-mediated isothermal amplification detection technique for common subtypes of bacterial resistance gene blaNDM 2020 - 06 - 08 发布 山东省市场监督管理局 2020 - 07 - 08 实施 发 布 DB37/T 3997—2020 前 言 本标准按照GB/T 1.1－2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准主要起草单位：山东省农业科学院畜牧兽医研究所、山东润达检测技术有限公司。 本标准主要起草人：齐静、刘玉庆、杜以军、李璐璐、胡明、骆延波、张庆、张印、赵效南、任金 瑞、刘军伟、王怀中、陶海英。 I DB37/T 3997—2020 细菌耐药基因 blaNDM 常见亚型的环介导等温扩增检测技术 1 范围 本标准规定了细菌耐药基因blaNDM常见亚型（blaNDM-1、blaNDM-4、blaNDM-5和blaNDM-9）的环介导等温扩增 LAMP（Loop-Mediated Isothermal Amplification）检测技术的操作步骤。 本标准适用于实验室及临床样本的细菌耐药基因blaNDM常见亚型（blaNDM-1、blaNDM-4、blaNDM-5和blaNDM-9） 的快速可视化检测，其他几个亚型的检测可以参考使用。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 16489 水质 硫化物的测定 亚甲基蓝分光光度法 3 试验原理 本标准所应用的试验原理为：根据序列保守区域设计一对外引物、一对内引物和一对环引物特异性 识别靶序列上六个独立区域，在Bst DNA聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，大量合成目标DNA的同 时伴随有副产物焦磷酸镁白色沉淀产生，可以实现恒温扩增和快速检测，结果通过肉眼即可判定。 4 试剂或材料 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 除非特别规定所用试剂均用分析纯水：符合国标GB/T 6682一级水的规定。 Bst DNA 聚合酶。 0.5×TBE 缓冲液：配制见附录 A.2。 2 %琼脂糖电泳液：配制见附录 A.3。 无毒核酸染料。 DNA Marker 2000。 商品化的细菌基因组 DNA 提取试剂盒。 引物：blaNDM 基因几个国内常见亚型的 LAMP 检测引物如下： ——外引物 F3：5’-GGCCACACCAGTGACAAT-3’； ——外引物 B3：5’-GCGGAATGGTCATCACGAT-3’； ——内引物 FIP：5’-ACTTGGCCTTGCTGTCCTTGATGTTGGGATCGACGGCAC-3’； ——内引物 BIP：5’-CGCTCGGCAATCTCGGTGATGCTGGCCTTGGGGAACGC-3’； ——环引物 LF：5’-GCTGTAGCGAAAACCACCG-3’； ——环引物 LB：5’-ACACTGAGCACTACGCCG-3’。 1 DB37/T 3997—2020 5 仪器设备 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 微量移液器：10 μL、20 μL、100 μL、1 000 μL。 低温高速离心机：离心力 20 000 g。 电热恒温水浴锅。 稳流稳压电泳仪。 水平电泳槽。 凝胶成像系统。 电子分析天平：精度 0.001 g。 6 试验步骤 6.1 样品 在生物安全柜中，将采集的样品（如人或动物的肛拭子、鼻拭子或肝脏、脾脏、脑等不同脏器组织 等）无菌划线特异性筛选培养基或哥伦比亚血琼脂培养基，置37 ℃培养箱过夜培养12 h～18 h，获得 细菌单菌落，经二次纯化后，挑取单菌落于BHI营养肉汤中过夜培养12 h～18 h，用于提取细菌基因组 DNA。 6.2 DNA 的提取 收集过夜培养的待检细菌菌液1 mL（菌液浓度的OD600值大于1.0）到1.5 mL的EP管中，12 000 g离 心2 min，彻底弃上清，取沉淀用商品化的细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌基因组总DNA，最后溶于 50 μL灭菌水中，测定DNA的浓度，-20 ℃保存备用。 6.3 反应体系 反应体系见表1。 表1 环介导等温扩增 LAMP 反应体系 1 2×等温缓冲液(RM) 12.5 μL 2 外引物 B3/F3(100 μM ) 0.1 μL×2 3 内引物 BIP/FIP(100 μM) 0.4 μL×2 4 环引物 LF/LB (100 μM) 0.2 μL×2 5 Bst DNA 聚合酶 1.0 μL 6 细菌基因组 DNA 2.0 μL 7 灭菌水 8.1 μL 其中：2×等温反应缓冲液RM[含有40 mM pH为8.8的Tris-HCl、20 mM KCl、16 mM MgSO4、20 mM（NH4） 2SO4、0.2wt% Tween20、1.6 M甜菜碱、2.8 mM dNTP]。 6.4 扩增 检测blaNDM基因的LAMP反应体系，包括若干个装有反应液的LAMP反应管（25 μL/管），在每个LAMP 反应管内设置LAMP反应体系，详见表1。每次LAMP反应均应设置1管为阳性对照，加入1.0 μL含有细菌 blaNDM-1基因的洛菲不动杆菌基因组DNA（300 ng/μL）；设置1管为阴性对照，加入1.0 μL的灭菌水取 代细菌基因组DNA。 2 DB37/T 3997—2020 将上述LAMP反应管轻轻混匀后，置恒温水浴锅中进行扩增，如果选择荧光目视检测，可以选择在表 1步骤5之后每个LAMP反应管中添加1.0 μL钙黄绿素，相应地整个25 μL体系中减少1.0 μL灭菌水，再 加入相应地细菌基因组DNA，轻轻混匀后，置恒温水浴锅中进行扩增，具体参数见表2。 表2 LAMP 反应程序设定 步骤 温度 时间 功能 1 65 ℃ 40 min 恒温扩增 2 80 ℃ 5 min 灭活酶处理 试验过程注意事项： LAMP反应产物极易产生气溶胶污染，是LAMP研究中首要避免的因素之一。控制气溶胶污染的解决方 法为：1、对核酸提取和扩增进行严格分区，2、反应全程禁止开启反应管。3、配置LAMP反应体系尽量 在冰上进行，操作Bst DNA聚合酶时不能用涡旋振荡器过激搅拌，避免酶的失活，应该使用轻轻弹击反 应管或颠倒混匀的方式进行，操作过程尽量避免产生气泡。 7 结果分析和判定 7.1 感官结果分析和判定 7.1.1 反应结束后，观察反应管内液体的颜色和状态，如果底部出现与阳性对照一样的白色沉淀为阳 性结果（参见附录 B：图 1A 泳道 1 所示），如果不出现白色沉淀为阴性结果（参见附录 B：图 1A 泳道 2）。 7.1.2 如果在扩增反应前，每个反应管中加入 1.0 μL 钙黄绿素，反应结束后扩增产物变为与阳性对 照一样的绿色为阳性结果（参见附录 B：图 1A 泳道 3），橙色的为阴性结果（参见附录 B：图 1A 泳道 4）。 7.2 电泳结果分析和判定 7.2.1 2 %琼脂糖凝胶板的制备（参见附录 A.3） 称取2.0 g琼脂糖，加入100 mL 0.5×TBE缓冲液（参见附录A.2）中，加热融化，温度降低至55 ℃ 后加入1 %的无毒核酸染料，倒入电泳槽中冷却待用。 7.2.2 加样 将LAMP扩增产物5 μL与1 μL 6×Loading Buffer混合，点样于2 %琼脂糖凝胶孔中，以DNA Marker 2000作相对分子质量指示。每次电泳至少加1孔阳性和1孔阴性的扩增产物作对照。 7.2.3 电泳及结果判定 保持稳定电压80 V，电泳20 min，电泳反应结束后，在阳性和阴性对照成立的情况下，出现瀑布样 条带的泳道判为阳性，说明待测样品中含有超级细菌blaNDM基因（参见附录B：图1B泳道1和3），不出现 瀑布样条带的为阴性（参见附录B：图1B泳道2和4）。 3 DB37/T 3997—2020 AA 附 录 A （规范性附录） 试剂的配制 A.1 10×TBE缓冲液 三羟甲基氨基甲烷（Tris） 乙二胺四乙酸（Na 2 EDTA.2H 2 O） 硼酸（Boric acid） 灭菌水 pH调至8.3 108 7.44 55 1 g g g L A.2 0.5×TBE缓冲液 取10×TBE缓冲液25 mL，加灭菌水475 mL，制成0.5×TBE的工作液。 A.3 2 %琼脂糖电泳液 琼脂糖 0.5×TBE缓冲液 2.0 g 100 mL 4 DB37/T 3997—2020 BB 附 录 B （资料性附录） LAMP 反应管阳性和阴性扩增产物可视化和电泳结果 说明： A——泳道1代表扩增产物中出现底部的白色沉淀，阳性；泳道2代表扩增产物中无白色沉淀，阴性；泳道3代表 扩增产物中液体呈绿色，阳性；泳道4代表扩增产物中液体呈橙色，阴性； B——泳道1和3代表扩增产物呈瀑布样条带，阳性；泳道2和4代表扩增产物无特异性条带，阴性。 图B.1 LAMP 反应管阳性和阴性扩增产物可视化和电泳结果 _________________________________ 5